體外抗氧化活性評價方法的反應機理研究進展

曾文俊，呂彩夢，丁建寶，李艷萍，馬建龍，楊 銳，楊 晉,4*

(1.北方民族大學化學與化學工程學院，寧夏 銀川 750021；2.國家民委化工技術基礎重點實驗室，寧夏 銀川 750021；3.寧夏五行科技有限公司,寧夏 銀川 750001；4.寧夏天然藥物工程技術研究中心，寧夏 銀川 750021；5.寧夏大學化學化工學院，寧夏 銀川 750021)

活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)自由基是引起基因突變的活性小分子原子基團，也是引起機體氧化應激(oxidative stress，OS)的主要因素。正常情況下，人體內自由基的產生和清除是一個動態的平衡，當平衡被破壞，自由基在體內累積過多時，會損傷蛋白質、DNA和脂質過氧體等生物分子，引發各種疾病，如動脈粥樣硬化[1-2]、心血管疾病[3]、糖尿病[4-5]、腫瘤[6-7]、癌癥[8]等。一般認為，自由基氧化反應是包含自由基的產生、傳遞及終止等多個步驟的鏈式反應，反應式如下：

R·+O2→ROO·

自由基的傳遞：RH+ROO·→ROOH+R·

ROOH→RO·+·OH

R·+R·→R-R

自由基的終止：R·+ROO·→ROOR

ROO·+ROO·→ROOR+O2

研究表明，抗氧化劑可以通過抑制自由基生成或阻斷自由基鏈式反應來實現抗氧化作用。抗氧化劑的研究思路[9]一般是通過抗氧化活性評價篩選出有益人體健康的化合物，體外抗氧化實驗不僅沒有以動物為模型的體內抗氧化實驗存在的生命倫理等諸多問題，而且能較為準確地反映抗氧化劑的抗氧化能力，可幫助研究人員篩選出合適的抗氧化劑，是目前普遍使用的方法。目前，體外抗氧化活性評價方法主要有化學分析法和細胞抗氧化活性(cellular antioxidant activity，CAA)法，不同評價方法的實驗原理、適用范圍各不相同，所得結果也有差異。作者在此對常用的體外抗氧化活性評價方法的反應機理研究進展進行綜述，為準確評價抗氧化活性提供參考。

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1 化學分析法

根據抗氧化方式，可以將化學分析法分為還原能力測定、自由基清除能力測定、溯源抑制作用測定等。

1.1 還原能力測定

抗氧化劑可以通過提供電子的形式清除自由基，因此抗氧化活性可用還原能力表示，即以相當于標準物質的還原能力的量表示。還原能力越強，抗氧化活性就越高。

還原能力測定，是利用抗氧化劑的還原性將高價金屬離子還原成低價金屬離子，在相應顯色劑作用下表現出光學差異，以此反映還原能力。根據金屬離子的不同，還原能力測定可以分為鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant power，FRAP)測定、銅離子還原能力(cupric reducing antioxidant capacity，CUPRAC)測定[10-11]和普魯士藍法[12-13]，最常用的是FRAP法。FRAP法最早被用于測定血漿的還原能力[14]，后被廣泛用于天然植物抗氧化劑的還原能力測定[15-18]，作為評價抗氧化活性的標準之一。此外，用于測定總酚含量的福林酚法[19]也被用于測定還原能力，所以抗氧化劑的還原能力與多酚含量呈正相關，且相關系數較高[20-21]。

用還原能力評價抗氧化活性只能說明抗氧化劑具有還原能力，能夠向缺電子自由基提供質子，但不能直接說明抗氧化劑是通過清除自由基來表現抗氧化活性。因此，還原能力測定常與自由基清除能力測定聯合使用，來評價抗氧化劑的活性是否通過電子轉移(electron transfer，ET)途徑清除自由基實現。

1.2 自由基清除能力測定

自由基清除能力測定，是在自由基溶液中加入抗氧化劑，根據所產生的光學差異來反映抗氧化活性。自由基清除能力測定是最常用的抗氧化活性評價方法，其反應機理有電子轉移[22-23]、氫轉移(hydrogen atom transfer，HAT)及脂質過氧化抑制機制。

1.2.1 基于電子轉移的自由基清除能力測定

自由基的種類可分為氮自由基和氧自由基。基于電子轉移的自由基清除能力測定主要有ABTS法、DPPH法、PTIO法和·OH法等，由于ABTS自由基在水與醇溶液中有良好的溶解性，因此ABTS法可用來評價絕大多數抗氧化劑的活性[24-25]；DPPH自由基是醇溶性自由基[26]，因此DPPH法僅能用來評價醇溶性或者樣品量相對較少的水溶性抗氧化劑的活性，且當水溶性抗氧化劑的量較多時，可能會產生絮狀漂浮物，特別是多糖類抗氧化劑[27]。PTIO自由基是水溶性的一氧化氮自由基，PTIO法是近幾年開發的抗氧化活性評價方法，已被Li[28]證實可用于評價大多數抗氧化劑的活性。ABTS、DPPH、PTIO自由基的清除機理(圖1)均為：過氧自由基(ROO·)溶液在抗氧化劑(以抗壞血酸為例)的作用下，得到電子或/和發生質子轉移從而被清除[29-30]，而自由基溶液會發生顏色變化，據此可評價抗氧化劑的活性。

圖1 ABTS、DPPH、PTIO自由基的清除機理Fig.1 Scavenging mechanism of ABTS,DPPH,and PTIO free radicals

(1)

(2)

2半脫氫抗壞血酸+2H2O+Fe2+

(3)

1.2.2 基于氫轉移的自由基清除能力測定

氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)法是一個經典的基于氫轉移的自由基清除能力測定方法，是利用自由基產生劑(AAPH)產生氫過氧自由基，與熒光物質3′，6′-dihydroxy spiro[isobenzo furan-1[3H]，9′[9H]-xanthen]-3-one(FL)反應生成非熒光物質FL4，整個過程可以用FL的過氧化機制(圖2)闡明[38]。抗氧化劑可以抑制或消除氫過氧自由基以減少FL4的生成，從而產生光學差異，基于抗氧化活性與熒光衰退曲線延緩部分面積(Net AUC)相關(圖3)來評價其抗氧化活性，結果一般以ORAC值表示[39]。

圖2 FL的過氧化機制Fig.2 Peroxidation mechanism of FL

圖3 抗氧化活性與熒光衰退曲線延緩部分面積(Net AUC)的關系曲線Fig.3 Relationship curve of antioxidant activity and Net AUC of fluorescence decay curve

總自由基清除能力(total radical-trapping antioxidant parameter，TRAP)法的反應機理與ORAC法相同，但該法的熒光底物是R-藻紅蛋白，抗氧化活性與熒光衰退曲線最大斜率的滯后期相關[40]。

此外，基于氫轉移的自由基清除能力測定方法還有β-胡蘿卜素漂白法[43-44]，即β-胡蘿卜素亞油酸體系中的亞油酸會發生自氧化產生自由基使β-胡蘿卜素褪色，而抗氧化劑會延遲褪色時間，基于吸光度的變化可評價抗氧化活性，結果一般以抑制率表示。

1.2.3 基于脂質過氧化抑制機制的自由基清除能力測定

脂質中的不飽和脂肪酸自氧化生成不穩定的脂質過氧化物，再進一步分解產生ROS、氫過氧化物及丙二醛等一系列自由基，這些自由基會引起細胞膜功能障礙、生物酶活性降低、細胞成分降解，導致細胞氧化損傷，與人體的動脈粥樣硬化、高血糖、高血脂等心腦血管疾病的發生發展密切相關[45-47]。在評價抗氧化劑的體外抗氧化活性時，最常用的是脂質過氧化抑制實驗：以小鼠肝臟勻漿[48]、小鼠肝臟線粒體懸浮液[49]或雞蛋黃勻漿[50]作為脂質源，氧化分解產生丙二醛及其類似物，采用硫代巴比妥酸反應法測定，而抗氧化劑會抑制丙二醛及其類似物的生成，致使反應溶液的吸光度發生改變，基于空白組與實驗組之間的光學差異來評價抗氧化劑的抗氧化活性。

1.3 溯源抑制作用測定

溯源抑制就是追溯本源，抑制上游氧化酶活性，減少ROS等自由基的生成，抑制氧化反應的發生，從而達到抗氧化的目的。當下研究熱點是黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)，在核酸的分解代謝中，XOD不僅會催化黃嘌呤與次黃嘌呤氧化生成尿酸，而且能夠產生超氧陰離子和過氧化氫等過氧化物自由基，因此抑制XOD活性能夠間接減少體內自由基的生成[51]。在評價抗氧化劑的體外抗氧化活性時，常以黃嘌呤為底物、XOD為反應劑，XOD催化黃嘌呤產生的尿酸于290 nm處顯示特征吸收峰，而抗氧化劑會抑制XOD的活性，減少尿酸的生成，致使吸光度發生變化，基于空白組與實驗組之間的光學差異來評價抗氧化劑的抗氧化活性，結果一般以抑制率[52-53]或相對活性[51]表示。

2 細胞抗氧化活性法

CAA法是以細胞培養為基礎的活性評價方法，用來研究抗氧化藥物分配進入細胞膜、被吸收、與載體或酶等生物大分子相互作用、清除細胞內氧自由基的有效方法，能更準確、更接近地闡述抗氧化藥物在生物體體內的抗氧化反應機理，比化學分析法更具生物相關性。CAA法率先由Wolfe等[54]以人肝癌細胞HepG2為模型提出，其反應機理如圖4所示。

圖4 細胞抗氧化活性法的反應機理Fig.4 Reaction mechanism of cellular antioxidant activitymethod

HepG2細胞用抗氧化劑(AOX)與本身無熒光的指示劑2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)的混合物預處理；抗氧化劑結合在細胞膜上，并通過細胞膜進入細胞；DCFH-DA擴散到細胞中，細胞酯酶裂解二乙酸部分，在細胞內形成極性更強的還原型二氯熒光素(DCFH)；然后用2，2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(ABAP)處理細胞，ABAP能夠擴散到細胞中產生ROO·；ABAP能自發分解產生ROO·，ROO·攻擊細胞膜產生更多的自由基或ROS；細胞內的DCFH極易被ROO·和ROS氧化為有熒光的氧化型二氯熒光素(DCF)。抗氧化劑可在細胞外清除或結合ROO·，并且能清除或結合細胞內的ROO·和ROS,防止DCFH的氧化，減少DCF的形成，基于空白組與實驗組之間的光學差異來評價抗氧化劑的抗氧化活性。

在CAA法建立后，許多研究小組在此基礎上，使用不同的致傷劑建立氧化應激模型，如張業尼等[55]和Zhao等[56]建立了以過氧化氫誘導HepG2細胞的氧化應激模型；龔業滔等[57]建立了以乙酰氨基酚誘導HepG2細胞的氧化應激模型。此外，為了更好地模擬抗氧化劑作用機體的效果，往往會根據抗氧化劑作用機理和目標作用部位，選擇特定的細胞株，如人肝細胞L02[58-59]、人結腸癌細胞Caco-2[60-61]等。

3 結語

不同評價方法的實驗原理、適用范圍各不相同，所得結果也有差異。化學分析法較CAA法簡單，實驗周期短，但不能全面反映抗氧化劑的活性及其在生物細胞內的吸收、代謝和利用等情況。若要準確地評價抗氧化活性，需同時采用多種方法。如將不同自由基清除能力相結合、化學分析法與CAA法相結合等，以綜合評價抗氧化活性。此外，還必須結合抗氧化劑的作用部位、溶解性等諸多因素選擇評價方法，從而客觀、準確地評價抗氧化活性。