基于網絡藥理學探討益腎清肝方逆轉乳腺癌內分泌治療耐藥機制

桂越蓉，王爍，董軍，周彤，王丹丹，侯煒

中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053

全球癌癥統計最新數據顯示，2020年乳腺癌新發病例230萬例（11.7%），已超過肺癌成為全球發病率最高的惡性腫瘤；死亡68.5萬例，為全球第五大癌癥死亡原因[1]。2020年我國乳腺癌新發病例約42萬例，發病率居全球第一，死亡約11.7萬例，居女性惡性腫瘤死亡首位[2]。70%～80%乳腺癌患者表達雌激素受體（estrogen receptors，ER），內分泌治療（endocrine therapy，ET）已成為ER陽性乳腺癌患者主要且有效的治療方式[3]。有研究發現，在晚期ER陽性乳腺癌患者中，僅有20%～40%對一線ET方案有效，其中約50%在治療8～14個月后因ET耐藥而發生復發及轉移[4]。因此，逆轉乳腺癌ET后繼發耐藥，提高乳腺癌對ET的敏感性，繼而防止耐藥后腫瘤復發轉移，是臨床亟待解決的難題。

近年來，中醫藥在逆轉化療耐藥方面顯示出一定的優勢，已有研究顯示，中醫藥能逆轉順鉑、阿霉素（ADR）等化療耐藥，提高其抗腫瘤活性[5-6]。乳腺癌患者在ET期間，由于藥物干預雌激素功能發揮，出現類更年期癥狀，本院林洪生教授認為該階段的中醫病機以腎虛為本，患者還表現出烘熱汗出、煩躁易怒、頭暈耳鳴、心悸失眠、筋急骨痛等癥狀，為肝火內擾之象，故確立了乳腺癌ET期間以益腎清肝為主的治療大法。益腎清肝方是林洪生教授以丹梔逍遙散為主加減治療乳腺癌ET耐藥的臨床經驗方，結合既往研究成果組方而成，藥用白芍、丹參、柴胡、牡丹皮、當歸、苦參、山萸肉、澤瀉、熟地黃、梔子，臨床實踐顯示該方有不同程度的抑制腫瘤生長、延緩耐藥、提高機體免疫功能等功效，但其作用機制尚不清楚。本研究基于網絡藥理學和分子對接探索益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥的潛在靶點與可能機制，為該方的應用提供實驗研究基礎。

1 資料與方法

1.1 益腎清肝方活性成分及靶點篩選

通過TCMSP數據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）[7]分別檢索益腎清肝方組方藥物白芍、丹參、柴胡、牡丹皮、當歸、苦參、山茱萸、澤瀉、熟地黃、梔子的化學成分，時間截至2021年7月24日。根據TCMSP的ADME參數[8-9]，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為標準，篩選具有較高活性的化合物。在相關靶點（related targets）搜索欄過濾出活性成分對應的靶蛋白，借助UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）[10]查詢靶蛋白所對應的人類基因名稱。

1.2 乳腺癌內分泌治療耐藥相關靶點檢索

以“Breast cancer resistance to endocrine therapy”為關鍵詞，檢索GEO數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），獲得乳腺癌ET耐藥的原始基因表達譜數據（GSE67916）[11]。該數據包括4個對他莫昔芬耐藥的乳腺癌細胞系（TamR MCF7/S0.5）TamR1、TamR4、TamR7、TamR8及1個對他莫昔芬敏感的乳腺癌細胞系MCF7/S0.5，分析了2種細胞系的差異基因表達譜（基因芯片平臺GPL570）。將耐藥株設置為試驗組，敏感株設置為對照組，進行GEO2R分析。導出全部分析結果，以P＜0.05、logFC＞1或logFC＜-1為篩選閾值，獲得乳腺癌ET耐藥相關差異表達基因。

1.3 蛋白相互作用網絡構建及核心靶點篩選

將篩選得到的藥物靶點與疾病差異基因分別去重，然后取交集得到共同靶點，為益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥的潛在作用靶點。登錄STRING11.5數據庫（https://string-db.org/）[12]，選擇“multiple protein”模式，上傳活性成分與疾病的交集靶點，物種選擇“Homo sapience”，設置最低相互作用閾值“medium confidence（0.400）”，隱藏網絡中的游離節點，下載tsv文件，導入Cytoscape3.8.2構建蛋白相互作用（PPI）網絡，根據節點度值篩選益腎清肝方逆轉ET耐藥的關鍵靶點。

1.4 GO和KEGG通路富集分析

將藥物與疾病的交集靶點導入Metascape基因功能注釋分析工具（https://metascape.org/）[13]，進行GO和KEGG通路富集分析。物種輸入選擇“Homo sapience”，設定富集的統計顯著性“P Value Cutoff=0.01”，獲得益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥潛在靶點的主要基因功能及參與的信號通路。將富集結果按P值升序排列，分別對GO富集的前10位條目和KEGG富集的前20位條目進行可視化展示。將KEGG富集的前20條通路所包含的靶點及活性成分導入Cytoscape3.8.2構建靶點-活性成分-通路網絡。

1.5 分子對接

將益腎清肝方逆轉ET耐藥的主要活性成分與關鍵靶點進行分子對接，以驗證成分與靶點之間的結合活性。檢索蛋白質晶體數據庫PDB和PubChem，得到靶點與活性成分的三維及化學結構，使用PyMOL軟件對蛋白質分子進行去水、去磷酸根等操作，利用AutoDock Tools 1.5.6將化合物與靶點蛋白pdb格式轉為pdbqt格式并尋找活性口袋，最后運行AutoDock Vina 1.2.0進行對接。一般認為，結合能＜-4.25 kcal/mol表示配體小分子與受體蛋白之間有一定的結合活性，結合能＜-5.0 kcal/mol表示二者之間有較好的結合活性，結合能＜-7.0 kcal/mol表示成分與靶點具有強烈的結合活性[14]。

2 結果

2.1 益腎清肝方活性成分、靶點及乳腺癌內分泌治療耐藥靶點

通過TCMSP數據庫獲得益腎清肝方中藥物1 375個化學成分（白芍85個，丹參202個，柴胡349個，牡丹皮55個，當歸125個，苦參113個，山茱萸226個，澤瀉46個，梔子98個、熟地黃76個），按OB≥30%、DL≥0.18標準共篩選出活性化合物176個，包括白芍13個，丹參65個，柴胡17個，牡丹皮11個，當歸2個，苦參45個，山茱萸20個，澤瀉10個，梔子15個，熟地黃2個，26個為共有成分。176個候選化合物中，124個可以在TCMSP數據庫中匹配到共2 615個人類靶點，去重后最終得到254個。通過在GEO數據庫中對MCF7耐藥株和敏感株的差異基因表達譜進行分析，共獲得差異表達基因1 857個（見圖1），去除重復后獲得1 467個乳腺癌ET耐藥相關靶基因。

圖1 乳腺癌ET耐藥差異表達基因火山圖

2.2 交集靶點蛋白相互作用網絡

將藥物靶點和ET耐藥相關靶點取交集共得到30個共同作用靶點。將交集靶點導入STRING平臺生成PPI網絡，利用Cytoscape3.8.2進行可視化（見圖2）。該網絡包含28個節點、158條邊。其中度值、介數大的靶點預測是益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥的關鍵靶點，前8位關鍵靶點拓撲參數見表1。

圖2 益腎清肝方與乳腺癌ET耐藥交集靶點PPI網絡

表1 益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥關鍵靶點拓撲參數

2.3 GO和KEGG富集分析結果

將益腎清肝方逆轉ET耐藥的交集靶點導入Metascape平臺進行GO和KEGG富集分析。GO分析得到生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）各418、33、39條。取P值排名前10位的條目，進行可視化分析（見圖3）。其中生物過程主要包括細胞成分運動的正向調節（positive regulation of cellular）、生殖結構發育（reproductive structure development）、生殖系統發育（reproductive system development）、對細胞因子的反應（response to cytokine）、對 荷 爾 蒙 的 反 應（response to hormone）等。

圖3 益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥靶點GO富集分析

KEGG富集分析共得到114條信號通路，對前20條信號通路進行可視化展示（見圖4）。益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥涉及多條信號通路，主要包括FoxO信號通路（FoxO signaling pathway）、P53信號通路（P53 signaling pathway）、雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等。

圖4 益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥靶點KEGG通路富集分析

2.4 活性成分-靶點-通路網絡

將KEGG富集的前20條通路所涉及的活性成分及靶點導入Cytoscape3.8.2軟件，構建靶點-活性成分-通路網絡（見圖5）。該網絡共有56個節點、193條連線，包含靶點25個、益腎清肝方活性成分11個。按度值降序排列，活性成分的拓撲參數見表2。

圖5 益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥活性成分-靶點-通路網絡

表2 益腎清肝方核心活性成分拓撲參數

2.5 分子對接結果

將益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥的前8個關鍵靶點分別與主要活性成分進行分子對接。分子對接結果顯示結合能均小于0，表明益腎清肝方活性成分與關鍵靶點之間均存在結合活性，且所有活性成分分別與MAPK1、PGR、MAPK8關鍵靶點之間具有強烈的結合活性，結合能均小于-7.0 kcal/mol，其中PGR與活性成分之間的結合活性最佳（見圖6）。

圖6 益腎清肝方核心活性成分與關鍵靶點分子對接熱圖

3 討論

益腎清肝方中牡丹皮、梔子、當歸、白芍、柴胡取丹梔逍遙散之意，養血柔肝、滋肝陰、瀉肝火。有研究顯示，丹梔逍遙散能有效改善乳腺癌患者ET后類更年期綜合征，且不影響性激素水平[15-16]。方中熟地黃、山萸肉滋腎益肝，澤瀉、牡丹皮利濕泄熱，四藥合用，一補一瀉，取六味地黃丸之意，肝腎陰并補，以滋腎陰為主，契合乳腺癌ET期間的病機；丹參一味功同“四物”，生血活血，行血而不傷正，以通為補，能間接起到補益作用。研究表明，隱丹參酮能抑制細胞膜上乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）寡聚物的形成，從而阻斷藥物流出，使乳腺癌細胞對化療敏感[17]。課題組既往研究表明，苦參提取物氧化苦參堿能抑制MCF7細胞的體外成球能力，體內能抑制乳腺癌腫瘤干細胞（BCSCs）荷瘤裸鼠的成瘤能力，而BCSCs是導致乳腺癌耐藥的主要原因之一[18]。以上均奠定了益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥的基礎。

本研究結果顯示，益腎清肝方逆轉ET耐藥的主要活性成分為β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、槲皮素、豆甾醇、苦參堿、隱丹參酮、兒茶素等，可能在乳腺癌ET耐藥中發揮重要作用。β-谷甾醇是一種廣泛存在于植物種子和果實中的天然植物固醇，其在體外能對多種腫瘤細胞產生增殖抑制作用[19]。Awad等[20]研究顯示，β-谷甾醇與他莫昔芬聯合使用能在體外顯著抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞的生長，其機制可能與β-谷甾醇刺激絲氨酸棕櫚酰轉移酶活性，從而增強細胞生長和神經酰胺（CER）促進的凋亡信號相關。BCSCs自我更新與上皮間質轉化（EMT）在乳腺癌ET耐藥及耐藥后的侵襲轉移中發揮重要作用[21]。有研究顯示，木犀草素可能通過下調乳腺癌細胞β-catenin的表達、抑制BCSCs的自我更新，進而抑制EMT過程，降低人乳腺癌細胞系MDA-MB-231和BT549細胞的侵襲和遷移能力[22]。腺苷三磷酸結合（ABC）亞家族蛋白成員是目前已知在腫瘤化療耐藥中發揮重要作用的蛋白家族成員[23-24]。有研究顯示，山柰酚與ADR聯合用藥后，可以降低ADR在MCF7耐ADR細胞（MCF7/ADR）中的IC50值，誘導MCF7/ADR細胞凋亡，其機制可能與山柰酚降低ABC亞家族蛋白成員ABCB1蛋白表達有關[25-26]。槲皮素是一種天然存在的具有良好生物活性的植物化學物質，對多種癌細胞系具有殺傷活性[27]。有研究顯示，在槲皮素作用下，他莫昔芬對耐藥細胞的增殖抑制和凋亡效應呈劑量遞增趨勢，提示槲皮素可能具有逆轉乳腺癌細胞對ET的耐藥性[28]。但由于槲皮素水溶性差、體內代謝快、半衰期短，導致生物利用度低，從而限制其在醫藥上的應用[27]?？鄥A是從苦參中提取的一種活性堿，能通過降低AKT的磷酸化，調節PI3K-Akt信號通路誘導的細胞凋亡，抑制MCF-7/ADR細胞的生長，逆轉乳腺癌的多藥耐藥[29]。隱丹參酮是從丹參中提取的一種脂溶性蒽醌類衍生物，有良好的抗炎、抗氧化及抗腫瘤活性[30]。Ni等[17]研究顯示，隱丹參酮能以ERα依耐性和非依耐性的方式抑制BCRP活性，增加乳腺癌對化療的敏感性。兒茶素是一種黃烷醇類化合物，具有明顯的抗癌活性。研究顯示，兒茶素及其衍生物能通過抑制ABC轉運蛋白P-gp、ABCB1介導的藥物外排，將細胞內藥物濃度恢復至細胞毒水平，增強細胞對藥物的敏感性[31]。以上均說明益腎清肝方的主要活性成分可能通過下調ABC轉運蛋白表達、抑制BCSCs自我更新、抑制PI3K-Akt等信號通路等機制發揮逆轉耐藥作用。

本研究通過PPI網絡對益腎清肝方的核心靶點進行了預測，結果顯示ESR1、TP53、STAT3、MAPK1、PGR等可能是益腎清肝方治療乳腺癌ET耐藥的關鍵靶點。雌激素受體α基因（ESR1）突變是導致乳腺癌ET耐藥最常見的原因，ESR1突變將引起ER活性提高和ER表達上調，甚至產生不依賴雌激素的自發活性[32]。研究顯示，接受內分泌治療后，15%～30%的乳腺癌患者會出現ESR1配體結合區域的突變，ESR1突變將縮短后續使用芳香化酶抑制劑類藥物治療患者的無進展生存期，從而產生ET耐藥[33]。TP53是一種重要的抑癌基因，大約30%的乳腺癌患者含有TP53基因的體細胞突變，超過80%的三陰性乳腺癌患者存在TP53點突變或缺失[34-35]。TP53突變可導致化療耐藥，與乳腺癌患者治療反應差和生存率下降有關[36-37]。腫瘤干細胞（CSCs）自我更新是癌癥進展和化療耐藥性的重要機制之一。Wang等[38]研究顯示，STAT3能通過上調BCSCs中肉堿棕櫚酰轉移酶1B（CPT1B）等編碼脂肪酸β-氧化關鍵酶（FAO）表達，促進BCSCs自我更新和乳腺癌化療耐藥，而抑制STAT3可下調CPT1B基因表達，阻斷BCSCs自我更新，恢復乳腺癌對化療的敏感性。MAPK1，也稱為ERK2，是Ras/Raf/ERK通路的主要成員，該通路在腫瘤細胞中過度激活，參與腫瘤細胞的增殖和惡性轉化，在某些腫瘤中，該通路的表達會通過調節藥物泵和抗凋亡分子參與腫瘤化療抵抗[39]。如Raf異常表達會使乳腺癌細胞中MDR-1藥物泵和抗凋亡蛋白Bcl-2的水平升高，參與乳腺癌耐藥[40]。孕激素受體（PGR）在臨床上被用作ER轉錄活性的生物標志物，是內分泌反應的有效調節劑。有研究顯示，當PGR在N末端氨基酸殘基Ser294上磷酸化時，會增強Her2信號通路、胚胎和CSCs生物學行為，增強乳腺癌內分泌抵抗[41-42]。

核心靶點GO富集分析顯示，生物過程主要涉及細胞成分運動的正向調節、生殖結構發育、生殖系統發育、對細胞因子的反應、對荷爾蒙的反應等。其中，對荷爾蒙的反應可能是參與ET耐藥的主要生物過程，而細胞成分運動的正向調節則在耐藥后復發轉移中發揮重要作用。KEGG通路富集分析顯示，益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥與多條信號通路有關，主要包括FoxO信號通路、P53信號通路、雌激素信號通路、PI3K-Akt信號通路等。FoxO轉錄因子是腫瘤抑制因子，其活性抑制在許多腫瘤的惡性行為中發揮中重要作用。有證據顯示，抑制FoxO通路將促進激素非依耐性乳腺癌生長的許多特征，包括ER功能的改變，并且FoxO信號通路與雌激素信號通路之間的串擾能降低ERα陽性乳腺癌細胞的惡性行為（侵襲性、遷移性和激素非依耐性生長），增加內分泌治療的敏感性[43]。P53蛋白由TP53基因編碼，是一種應激誘導的轉錄因子，P53異常表達與乳腺癌不良預后相關。研究表明P53也可影響抗雌激素治療的反應，如Fernandez-Cuesta等[44]發現P53突變的細胞比野生型P53細胞更能抵抗4-羥基他莫昔芬（OHT）的細胞毒作用，并且P53功能缺失會增加ER與EGFR/HER2通路之間的交叉反應，從而促進乳腺癌對OHT的抵抗作用。腫瘤耐藥性和轉移的發生是腫瘤細胞重新編程其代謝，以適應灌注不良、短暫的營養缺失及酸度增加的過程。有研究顯示，雌激素信號通路能和幾個關鍵代謝調節酶之間串擾，改變乳腺癌細胞的代謝，使腫瘤細胞能夠重新連接其代謝，以適應灌注不良、短暫營養缺乏和酸度增加，從而導致耐藥和轉移[45]。PI3K-Akt信號通路對細胞生長、存活、蛋白質合成和葡萄糖代謝至關重要。研究認為抑制PI3K-Akt信號通路可導致ER活性增加，促進耐藥，此外，PI3K-Akt信號通路還可與雌激素信號通路相互串擾，導致乳腺癌ET耐藥的發生[46]。

綜上，本研究通過網絡藥理學篩選益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥的主要活性成分及其靶點，對關鍵靶點進行GO和KEGG富集分析，獲得益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥關鍵靶點的主要基因功能和參與的信號通路。結果顯示益腎清肝方的主要活性成分β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、槲皮素、苦參堿、隱丹參酮及兒茶素等可能通過作用于ESR1、TP53、STAT3、MAPK1、PGR等多個靶點，從而影響FoxO、P53、雌激素、PI3K-Akt等多條信號通路發揮作用。分子對接結果顯示益腎清肝方主要活性成分與關鍵靶點對接活性良好，可為后續進一步深入探索益腎清肝方逆轉乳腺癌ET耐藥的作用機制奠定基礎。本研究的不足在于藥物活性成分均來源于數據庫，且數據庫的更新存在延遲，存在藥物成分錄入不全的情況。此外，本研究僅通過網絡預測，未考慮不同產地、劑量、炮制方法對藥物活性成分的影響，亦未考慮方中藥物在煎煮后成分變化的影響，因此研究結果尚需進一步實驗驗證。