N+注入技術(shù)選育猴頭菇菌株

譚一羅，蘇文英，任立凱，劉曉梅，秦裕營，楊和川

(連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222000)

猴頭菇因形似猴頭得名，又名猴頭蘑、刺猬菌等，在分類學(xué)上隸屬于擔(dān)子菌門、層菌綱、多孔菌目、齒菌科、猴頭菇屬。研究表明，猴頭菇具有保護(hù)胃黏膜、提高免疫力、抗腫瘤等多種藥理活性，且猴頭菇中的多糖等物質(zhì)有很高的保健品開發(fā)價值[1-3]。因此，選育優(yōu)質(zhì)猴頭菇菌株對猴頭菇栽培和保健品的開發(fā)具有重要意義。

近年來，離子束注入技術(shù)逐漸發(fā)展成新型的誘變育種手段，廣泛應(yīng)用于水稻、蔬菜、花卉、微生物等品種選育和改良，對豐富農(nóng)作物及微生物種質(zhì)資源、促進(jìn)農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域發(fā)展發(fā)揮了重要作用[4-8]。其中，低能離子束注入技術(shù)產(chǎn)生的能量沉積、動量傳遞、質(zhì)量沉積和電荷交換4個效應(yīng)具有損傷輕、變異率高、變異譜寬等優(yōu)點[9-10]。但是，低能離子束注入產(chǎn)生的具體生物學(xué)效應(yīng)仍不明確。本研究以猴頭菇作為試驗菌株，研究了離子注入對猴頭菇的生物學(xué)效應(yīng)，篩選潛在的優(yōu)質(zhì)菌株，為離子束技術(shù)在大型真菌中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

試驗菌株為猴頭菇920，來源于高郵食用菌研究所，菌種于4 ℃保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種保存和平板培養(yǎng)(MYG固體培養(yǎng)基)：麥芽糖10 g，酵母粉5 g，葡萄糖5 g，瓊脂粉13 g，水1 L，pH自然。液體發(fā)酵培養(yǎng)基(PDA液體培養(yǎng)基)：取新鮮、去皮馬鈴薯200 g煮沸過濾浸出液，葡萄糖20 g，MgSO40.5 g，KH2PO41.0 g，水1 L，pH自然。

1.1.3 離子束生物工程裝置

離子束生物工程裝置購自南京恒樂機(jī)電設(shè)備有限公司，型號LSZ-2，離子能量0～40 keV，離子束流0～15 mA，離子束均勻度≥90%，離子束直徑>200 mm。

1.2 方法

1.2.1 樣品稀釋及預(yù)處理

采用無菌操作將新鮮猴頭菇子實體置于無菌空白培養(yǎng)皿過夜，獲得新鮮猴頭菇孢子。用1 mL無菌水沖洗培養(yǎng)皿，收集孢子液。通過血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子液稀釋至濃度為105mL-1。取100 μL孢子液涂布于空白9 cm培養(yǎng)皿，置于超凈工作臺吹干后形成菌膜，鏡檢無細(xì)胞重疊后可準(zhǔn)備離子束注入。

1.2.2 N+注入

離子束注入儀按操作說明開機(jī)預(yù)熱并對靶室進(jìn)行滅菌，將形成菌膜的培養(yǎng)皿依次放入靶室內(nèi)，調(diào)節(jié)靶室真空至1×10-3～2×10-3Pa，打開氮氣充氣閥，維持靶室氣壓8×10-3～9×10-3Pa，注入能量為15 keV，注入劑量分別為1×1016、4×1016、8×1016、12×1016、16×1016、20×1016ions·cm-2。將同時放置在靶室內(nèi)抽真空但不注入劑量的培養(yǎng)皿作為空白對照。

1.2.3 存活率曲線測定

將注入后的培養(yǎng)皿及空白對照分別用1 mL無菌水洗脫，收集洗脫液至1.5 mL離心管中。取處理后的孢子液90 μL涂布于MYG培養(yǎng)平板，每個劑量10次重復(fù)，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)4 d，統(tǒng)計平板上形成的單菌落并繪制相應(yīng)的生存曲線。

1.2.4 突變菌株篩選及突變率統(tǒng)計

將離子束注入后的菌落進(jìn)行鎖狀聯(lián)合鑒定，挑選有鎖狀聯(lián)合的菌落分別保種并接種于MYG培養(yǎng)平板，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)7 d。采用5 mm直徑打孔器將菌絲平板打孔并將圓形菌塊分別接種于MYG培養(yǎng)平板中央，重復(fù)3次，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)，測量菌絲生長速率并評估菌絲長勢。菌絲長勢評分標(biāo)準(zhǔn)[11]為：5分，菌絲濃密且均勻；4分，菌絲濃密且較均勻；3分，菌絲較濃密且較均勻；2分，菌絲較稀疏但較均勻；1分，菌絲稀疏且不均勻。以猴頭菇920菌絲生長速度作為對照，生長速度超過對照10%的菌株記為正突變，反之記為負(fù)突變。

1.2.5 突變菌株復(fù)篩

挑選菌絲長勢優(yōu)良的正突變菌株，用5 mm直徑打孔器打孔，接種圓形菌塊至100 mL PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為每瓶3塊，25 ℃ 140 r·min-1搖床避光恒溫培養(yǎng)10 d。將菌絲打碎，吸取2 mL菌液接種至100 mL PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基，3次重復(fù)，25 ℃ 140 r·min-1搖床避光恒溫培養(yǎng)10 d。將菌絲過濾收集，隨機(jī)選取10個菌絲球測量平均直徑。將菌絲烘干至恒重，記錄菌絲生物量。

1.2.6 遺傳穩(wěn)定性試驗

將復(fù)篩篩選出的菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)5代，按照同樣方法分別測定5代菌株菌絲生長速度及液體發(fā)酵生物量，篩選無明顯退化的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 N+注入對孢子存活率的影響

圖1表明，隨著注入劑量的增大，孢子的存活率先下降，后上升，再下降，呈現(xiàn)“馬鞍型”效應(yīng)曲線。當(dāng)注入劑量較小時，由于N+注入損傷了細(xì)胞表面并發(fā)生刻蝕，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷或死亡，因此孢子存活率隨著注入劑量增大而降低；隨著劑量增大，離子的庫侖力形成屏障，同時，細(xì)胞損傷的加劇激活了細(xì)胞各種酶和修復(fù)機(jī)制，所以存活率回升；當(dāng)細(xì)胞損傷繼續(xù)加重至無法修復(fù)時，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，存活率下降。

圖1 注入劑量對孢子存活率的影響

2.2 N+注入對菌株突變率的影響

圖2顯示，突變率隨著N+注入劑量增加先上升，后下降，再上升。推測是由于一定劑量范圍內(nèi)，由于庫侖力的保護(hù)作用和細(xì)胞修復(fù)機(jī)制使突變率出現(xiàn)下降。負(fù)突變率受N+注入劑量的影響與總突變率一致，但正突變率隨N+注入劑量的走勢未發(fā)現(xiàn)明顯趨勢。

圖2 注入劑量對菌株突變率的影響

2.3 突變菌株初篩及復(fù)篩

棄除負(fù)突變菌株和無義突變菌株以及正突變菌株中菌絲長勢較差的菌株，試驗共篩選到菌絲生長濃密、旺盛、均勻的正突變菌株16株(表1)。該16株菌株菌絲生長速度快，8～9 d即可滿板；經(jīng)過液體發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩得到生物量高于出發(fā)菌株10%且菌絲球大小均勻的菌株6株，分別為H0121、H1206、H1211、H1215。

表1 突變菌株篩選結(jié)果

2.4 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性比較

突變菌株傳代5代的遺傳穩(wěn)定性見表2。菌株H1211和H1215在傳代5代過程中，其每代菌絲生長速率、液體菌絲發(fā)酵生物量均未出現(xiàn)明顯下降，說明該菌株遺傳性狀穩(wěn)定，優(yōu)于其他試驗菌株。菌株H0121、H1206在傳代過程中菌絲生長速率以及液體菌絲發(fā)酵生物量均發(fā)生下降，說明菌株可能發(fā)生了回復(fù)突變。

表2 遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果

3 討論

近年來，低能離子束注入技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物菌種改良和品種選育[12]。試驗采用6個劑量梯度的N+注入，突變率在30.77%～92.31%，說明離子束注入技術(shù)具有突變率高的優(yōu)勢。結(jié)合不同劑量處理的生存率和突變率，突變率在最高點時注入劑量為12×1016ions·cm-2，此時存活率也是峰值，因此，該劑量可以作為猴頭菇孢子誘變的最佳劑量。

目前，低能離子束對食用菌產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)未有一致結(jié)論。本研究猴頭菇孢子N+注入劑量的存活率曲線呈現(xiàn)“馬鞍型”曲線，與付永前等[13]和Chen等[14]結(jié)論一致；但汪維云[15]研究表明，灰樹花隨著N+注入劑量增大，細(xì)胞死亡率逐漸增大至100%，推測是由于灰樹花極不耐輻照所致。蔣益等[16]研究表明，云芝細(xì)胞突變率隨著N+注入劑量增大，呈現(xiàn)先升高、后降低、再升高的趨勢，與本試驗研究結(jié)果一致；但是，全衛(wèi)豐等[17]研究表明，桑黃細(xì)胞突變率隨著注入劑量增加，其突變率先上升后下降，且正突變率曲線也符合同樣趨勢。因此，目前研究結(jié)果的不一致推測是材料、方法的差異以及突變的不定向性和隨機(jī)性造成的。本研究運(yùn)用N+注入技術(shù)誘變猴頭菇菌株，篩選出1株遺傳性狀穩(wěn)定的猴頭菇菌株H1215，對比出發(fā)菌株其生長速率及液體發(fā)酵生物量分別提高了25.30%和30.67%，進(jìn)一步證實了基于低能離子束的誘變育種是可行的育種方法，但是誘變菌株在遺傳穩(wěn)定性上存在退化或回復(fù)突變，需要進(jìn)一步開展生產(chǎn)試驗驗證突變菌株的穩(wěn)定性和綜合性狀。