2,4-表油菜素內酯對高溫脅迫下金線蓮的影響

葉巧玲，董向陽，顏丹紅，屈雨晨，劉永立，胡海濤*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004； 2.玉環市農業農村和水利局，浙江 臺州 317600；3.浙江大學 新農村研究院，浙江 杭州 310058)

金線蓮又名金線蘭、金絲草、金不換等，為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，是我國傳統名貴藥材，具有較高的藥用價值，在民間素有“金草”“神藥”“烏人參”等美稱[1]。現代藥理研究表明，金線蓮具有抗腫瘤、降血糖、保肝、抗HBV和降血壓等功效，藥用價值和保健功能顯著，市場開發價值極高[2-3]。近年來，金線蓮的市場需求量巨大，價格居高不下，人工栽培是解決其供需矛盾的唯一途徑。金線蓮喜陰涼、潮濕的環境，適宜生長溫度為18～25 ℃，南方夏季35 ℃以上的高溫嚴重影響人工栽培金線蓮的產量[4]，雖然大棚栽培可以通過密閉水簾等方式降溫，但運行成本較高。因此，南方夏季高溫已成為制約金線蓮人工栽培產業推廣、發展的瓶頸，尋找緩解高溫脅迫的有效途徑是目前金線蓮人工栽培生產中急需解決的問題。迄今為止，僅林曉紅等[4]對高溫脅迫下金線蓮葉綠素熒光參數、SOD活性及電導率等生理指標進行了初步研究，未見有關緩解金線蓮夏季高溫脅迫的相應解決措施的報道。

油菜素甾醇類(BRs)是已公認的第六大類植物激素，具有促進細胞伸長和分裂、促進光合作用、提高植物抗逆性等作用[5]。大量研究[5-6]表明，BRs能有效提高植物的抗熱、抗寒、抗漬和抗旱等能力。吳進東等[7]研究了油菜素內酯對霍山石斛耐熱性的影響，發現外源噴施BR可以顯著增強霍山石斛耐熱性，緩解高溫脅迫對霍山石斛的傷害。陸兵等[8]發現外源EBR(2，4-表油菜素內酯)可以通過提高浙貝母葉片可溶性蛋白、葉綠素含量和抗氧化酶活性，來降低體內活性氧水平，進而提高浙貝母的耐熱性。張永平等[9]研究了EBR對高溫脅迫下甜瓜幼苗生理及光合特性的影響，結果表明，EBR處理顯著促進甜瓜幼苗生長，有利于高溫脅迫下抗氧化酶系統的維持和對光能的捕獲與轉換。目前，有關EBR對高溫脅迫下金線蓮耐熱性影響的研究鮮有報道。本文研究了EBR對高溫脅迫下金線蓮葉片中活性氧代謝及抗氧化系統的影響，以期為利用EBR緩解夏季高溫脅迫對金線蓮產生的危害提供理論和生產依據。

1 材料與方法

1.1 材料培養

試驗于2019年5—9月在浙江師范大學植物分子生理學實驗室進行。首先選取生長勢一致的金線蓮組培苗，以泥炭土為栽培基質進行定植，然后放入智能光照培養箱中培養4周；培養溫度為(25±1) ℃/(20±1)℃(晝/夜)，光周期12 h/12 h(晝/夜)，光照強度4 000 lx，相對濕度保持在70%～80%。

高溫處理前，先分別用1.0 μmol·L-1EBR、蒸餾水(均含0.02% Tween 20)噴施金線蓮植株，每株50 mL，連續噴灑4 d，使金線蓮苗充分吸收EBR。4 d后進行溫度處理，試驗設4個處理組合，每個處理50株：常溫噴蒸餾水、常溫噴EBR、高溫脅迫噴蒸餾水、高溫脅迫噴EBR。培養箱參數：常溫處理為(25±1) ℃/(20±1)℃(晝/夜)，高溫脅迫處理為(35±1) ℃/(30±1)℃(晝/夜)，除溫度處理不同，光強、濕度等其他因素均保持一致。高溫脅迫6 d后剪取金線蓮葉片進行各項指標的測定。處理編號：常溫噴施蒸餾水，Normal temperature(NT)；常溫噴施EBR，Normal temperature+EBR(BRNT)；高溫噴施蒸餾水，Heat temperature+H2O2(HT)；高溫噴施EBR，Heat temperature+EBR(BRHT)。

1.2 指標測定

1.2.1 活性氧測定

1.2.2 抗氧化劑測定

參照Costa等[12]的方法測定還原型抗壞血酸和總抗壞血酸的含量。測定D525，含量以mg·g-1表示。總抗壞血酸(AsA+DHA)含量通過被二硫蘇糖醇還原后的AsA測定，氧化型抗壞血酸(DHA)含量=總抗壞血酸-還原型抗壞血酸(AsA)。

GSH和總谷胱甘肽(GSH+GSSG)含量測定參考Anderson等[13]的方法。測定D412值，含量以mg·g-1表示。

1.2.3 抗氧化酶活性測定

SOD活性測定參照Stewart等[14]的方法，采用氮藍四唑(NBT)光還原法，將抑制NBT光還原的50%作為1個酶活單位(U)，酶活性以U·g-1表示。CAT活性測定參照Aebi的方法[15]，將D240每分鐘減少0.1作為1個酶活單位(U)，酶活性以U·g-1表示。采用Jiang等[16]的方法提取AsA-GSH循環酶。分別參照Nakano等[17]、Hossain等[18]、Foyer等[19]的方法，檢測APX、DHAR、MDHAR、GR的活性。APX和DHAR以D265每分鐘減少0.1作為1個酶活單位，酶活性均以U·g-1·min-1表示，GR和MDHAR以D340每分鐘減少0.01作為1個酶活單位。

1.3 數據分析

各指標測定重復3次，取平均值，使用SPSS軟件對平均數進行Duncan’s多重比較，分析差異顯著性，再用Origin軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 對金線蓮和H2O2含量的影響

表1 外源EBR處理對金線蓮產生速率和H2O2含量的影響

2.2 對金線蓮SOD和CAT活性的影響

柱上無相同小寫字母表示組間差異達顯著水平(P<0.05)，圖2～4同。圖1 外源EBR處理對金線蓮SOD、CAT活性的影響

2.3 對金線蓮抗壞血酸循環的影響

在AsA-GSH循環中，AsA含量、氧化還原狀態(AsA/DHA)比值與抗逆性呈正相關[20]。AsA通過APX酶參與清除細胞內的H2O2，以此減輕脅迫(高溫、低溫、鹽堿、紫外線等)下引發的氧化脅迫，植株內AsA的含量及AsA/DHA比值在一定程度上能夠反映植物的抗逆性強弱。在正常條件下，單獨EBR處理對AsA、DHA含量以及AsA/DHA比值無明顯影響(圖2)。與對照相比，高溫脅迫使金線蓮葉片AsA含量顯著下降，DHA含量升高；AsA/DHA比值與AsA含量變化趨勢一樣，顯著下降。而高溫脅迫下噴施外源EBR后，金線蓮葉片內AsA含量比未噴施組顯著增加，AsA/DHA比值也顯著提高；相反，DHA的含量顯著下降。由此說明，連續6 d的高溫脅迫下，AsA再生能力減弱，細胞氧化還原力降低，抗氧化能力下降，而外源EBR處理可以顯著提高金線蓮葉片內AsA含量及AsA/DHA比值，從而增強植株的抗逆能力。

圖2 外源EBR處理對金線蓮葉片中AsA和DHA含量的影響

2.4 對金線蓮谷胱甘肽循環的影響

GSH是AsA-GSH循環系統中重要的抗氧化劑，GSH可直接與活性氧自由基反應，并由GSH轉變為GSSG，GR利用NADPH的電子將GSSG還原為GSH，從而使細胞內谷胱甘肽庫保持在還原狀態，增強植物對逆境的抵抗力。正常溫度下EBR處理對GSH、GSSG含量以及GSH/GSSG比值無明顯影響，而高溫脅迫下，GSH含量顯著下降，GSSG顯著上升，GSH/GSSG比值顯著下降；高溫脅迫下，外源EBR處理較未噴施組顯著提高金線蓮葉片中GSH含量及GSH/GSSG比值，而且GSSG含量較對照顯著下降，其中GSH含量顯著上升(圖3)。外源EBR處理顯著提高了GSH含量及GSH/GSSG，表明外源EBR處理有利于維護谷胱甘肽系統的穩定性。

圖3 外源EBR處理對高溫脅迫下金線蓮葉片中GSH和GSSG含量的影響

2.5 對金線蓮AsA-GSH循環相關酶活性的影響

與常溫相比，高溫脅迫處理下金線蓮葉片中APX活性顯著下降，而外源EBR處理比未噴施顯著提高了金線蓮葉片中APX活性，從而保證H2O2可以被及時清除(圖4)。AsA-GSH循環的運轉效率與MDHAR、DHAR、GR等酶的活性密切相關，這些酶參與了AsA-GSH循環中AsA的再生。AsA被氧化形成MDHA，MDHA在MDHAR的作用下再生成AsA，或通過非酶促歧化形成DHA，在DHAR參與下DHA可以再生形成AsA。植株AsA-GSH循環酶并不直接作用于活性氧物質，其作用機制主要是為了保持體內抗氧化物質AsA、GSH的還原性，與H2O2的清除密切相關。在正常條件下，EBR處理對MDHAR、DHAR、GR活性無顯著影響。高溫脅迫導致金線蓮葉片中MDHAR、DHAR、GR等酶活性比對照均顯著降低，而外源EBR處理可以使金線蓮葉片中AsA-GSH循環中MDHAR、DHAR、GR的活性均顯著提高。由此可見，外源的EBR處理可以通過提高金線蓮葉片中MDHAR、DHAR、GR的活性，保證其體內AsA含量水平，從而增強金線蓮的抗高溫能力。

圖4 外源EBR處理對金線蓮葉片APX、MDHAR、DHAR、GR活性的影響

3 討論

綜上所述，高溫脅迫下，噴施適宜濃度的外源EBR可以激活金線蓮的活性氧防御系統，從而增加活性氧清除能力，降低了ROS積累水平，進而減輕了高溫脅迫對金線蓮組織細胞的損傷程度，增強金線蓮植株抵抗高溫脅迫的能力。