轉移性宮頸癌細胞衍生的外泌體miR-21-5p 促進宮頸癌侵襲及轉移

楊翔 陳燁 鄭瑋 李虎 夏紅

宮頸癌是女性第四大常見惡性腫瘤，在全球范圍內，每年有近30 萬女性死于宮頸癌［1］。近年來，非編碼RNA（ncRNA）已成為惡性腫瘤相關領域的研究熱點［2-3］。微RNA-21-5p（miR-21-5p）作為腫瘤啟動子在許多類型的癌癥中發揮著作用［4-6］。許多研究顯示，miR 可以與mRNA 的3′-非翻譯區（3′-UTR）結合，從而負面地調節其匹配的靶基因，導致mRNA 降解或翻譯抑制［7］。據報道，快速發育生長因子同源蛋白2 抗體（SPRY2）在腫瘤細胞中表達異常，在細胞增殖和凋亡中發揮重要作用［8］。筆者前期研究發現，miR-21-5p 可以通過調節SPRY2 的表達來影響宮頸癌的增殖，但機制未明。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是目前已知的體內最重要的信號轉導體系。細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號轉導途徑被認為是經典的MAPK轉導途徑，參與了腫瘤的發生［9］。另外，腫瘤細胞釋放的外泌體（EXO）已被證明是有效傳遞的細胞間信號介質［10］。成熟的miR 約占EXO 核酸含量的47%，在親代腫瘤細胞釋放的miR 可轉移至近端或者遠端的細胞進而進行基因調節［11］。由此推測，miR-21-5p 可能靶向SPRY2，通過ERK/MAPK 信號通路調控宮頸癌SiHa 細胞的增殖和遷移，并可能通過旁分泌的作用，將EXO 中miR-21-5p 傳遞到毗鄰的健康細胞，促進腫瘤的轉移。本研究對這一假設進行探索，旨在深入了解宮頸癌的致病、轉移機制，并為宮頸癌的治療提供新的治療靶點。

材料與方法

一、研究對象

選擇2019 年1 月至2020 年7 月廣州市番禺區中心醫院收治的22 例轉移性宮頸鱗癌患者手術標本（癌組織、癌旁組織）和血清標本（病例組），以及22 名健康體檢者的血清標本（對照組），標本取出后立即置于?80 ℃以下液氮保存。所有的宮頸鱗癌患者均為新發病例，術前均未接受放射治療和（或）化學治療，病理診斷由2 名病理學專家根據WHO 分類標準進行診斷，患者臨床信息見表1。本研究經廣州市番禺區中心醫院醫學倫理學委員會批準［批件號：番醫倫審批（2018）第84號］，所有研究對象已簽署知情同意書。

表1 病例組和對照組的臨床特征［例（%）］

二、細胞及主要試劑

宮頸癌SiHa 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，胎牛血清、0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶溶液、青鏈霉素、DMEM 培養基及磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自美國Gibco 公司， miR-21-5p mimic、miR nc、miR-21-5p inhibitor、inhibitor nc 質粒及逆轉錄-實時熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒均購自廣州銳博生物技術有限公司，EXO RNA 提取試劑盒購自北京全式金生物技術股份有限公司，TRIzol 試劑購自廣州瑞真生物技術有限公司，PCR 所需引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司，lipofectamine 2000 試劑、蛋白免疫印跡法相關試劑及BCA 蛋白定量試劑盒均購自美國ThermoFisher 公司，磷酸化絲裂原和應激激活的蛋白激酶（p-MSK）、磷酸化核糖體S6蛋白激酶（p-90RSK）、磷酸化原癌基因C-RAF（p-C-RAF）、磷酸化MAPK 激酶（p-MEK）和磷酸化MAPK（p-MAPK）兔來源單克隆抗體均購自美國CST 公司，噻唑藍（MTT）試劑盒、結晶紫染液購自北京索萊寶科技有限公司，PKH-26 染料購自美國Sigma 公司。

三、方 法

1. 細胞培養和轉染

取對數生長期的宮頸癌SiHa 細胞用于實驗。根據Lipofectamine2000 脂質體說明書將5 μL miR-21-5p 模擬物、5 μL 陰性對照模擬物、5 μL miR-21-5p 抑制劑和5 μL 陰性對照抑制劑分別轉染到SiHa 細胞，轉染的細胞在恒溫箱培養48 h 后進行后續實驗。根據轉染物不同，實驗分為miR-21-5p模擬物（mimic-21）組、miR-21-5p 模擬物陰性對照（mimic nc）組、miR-21-5p 抑制劑（inhibitor-21）組和miR-21-5p 抑制劑陰性對照（inhibitor nc）組。

2. MTT 檢測

細胞轉染48 h 后，使用MTT 比色法檢測細胞的增殖能力。調節宮頸癌SiHa 細胞密度至1×104/孔，接種在96 孔板中，每組設置在5 個復孔。在37 ℃下培養2 h 后，酶標儀測量490 nm 處各孔吸光度（OD）值，從而計算細胞增殖指數。

3. RNA 分離和RT-qPCR

按照TRIzol 試劑盒的說明書提取細胞總RNA，SimpliNano 微量分光光度計檢測RNA 的濃度和純度。根據逆轉錄試劑盒說明書，逆轉錄合成模板DNA，進行RT-qPCR 檢測。引物序列：miR-21-5p 正向5′-CTCA ACTGGTGTCGTGGA-3′，反向5′-TCGGC AGGCAACAGC-3′；SPYR2 正 向5′-GGA CTGTGGCAAGTGCAAATGTA-3′，反 向5′-AAGGC ACTGCTTGTCGCAGA-3′；GAPDH 正 向5′-AGAAG GCTGGGGCTCATTTG-3′，反向5′-AGGGGCCATCC ACAGTCTTC-3′；U6 正向CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-△△Ct法計算相對表達量。

4. 細胞集落形成實驗

細胞轉染48 h 后，經胰蛋白酶消化處理，以400 個細胞/孔的密度接種在6 孔板上。細胞培養7～14 d，每3 d 更換培養基。最后進行細胞固定并使用結晶紫染色測定法進行染色。

5. Transwell 遷移實驗

細胞轉染48 h 后制備細胞懸液，在無胎牛血清的培養基中將其密度調整為1×105/mL。取200 μL 細胞懸液均勻地鋪到Transwell 的內室，外室加600 μL 完全培養基，37℃下培養24 h 后，用無菌棉簽去除內室細胞。4%多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色15 min。分別在顯微鏡下隨機選擇10個視野以計數遷移的細胞數并計算平均值。重復上述實驗3 次，每組3 孔。

6. 蛋白免疫印跡法

采用蛋白免疫印跡法檢測ERK / MAPK 信號通路的蛋白表達。使用增強化學發光（ECL）法檢測試劑盒顯影蛋白質，以GAPDH 為對照，計算各蛋白的相對表達量。

7. 雙熒光素酶報告

取對數生長期細胞，接種于24 孔板，培養24 h后，將SPRY2 野生型（WT） 或突變型（MUT）分別與inhibitor nc、inhibitor、mimic nc、mimic 共轉染入SiHa 細胞中，48 h 后清洗、裂解細胞，按要求上機檢測熒光素酶相對活性。

8. EXO 分離、鑒定及SiHa 細胞攝取的檢測

采用高速離心法提取EXO，提取出來的EXO用適量的PBS 重懸后，取10 μL 用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。EXO 用透射電子顯微鏡鑒定其形態，納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術測定其粒徑范圍，蛋白免疫印跡法檢測EXO 標志物CD9、CD63 及Alix 的表達情況。

用PKH26 染料標記EXO，孵育完成后，在4 ℃、120 000×g 的條件下離心90 min，再次重懸，混入完全培養基后與人臍靜脈內皮細胞避光共培養24 h。24 h 后，避光條件下，棄去舊培養基，細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3 次；4%多聚甲醛溶液室溫下固定30 min，PBS 再洗3 次；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） 染色10 min，PBS 洗3次；滴入抗熒光猝滅封片劑，熒光顯微鏡下拍照。

9. EXO RNA 提取

血清EXO RNA 提取過程中加入miR-39 作為外參，提取后加尾、逆轉錄及轉錄過程，參照miDETECT A TrackTMmiRNA RT-qPCR Starter Kit（Ribobio）說明書操作。

10. miR 靶基因預測

使用miRTarBase 數據庫對靶基因進行預測，數據庫網址為https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/。

四、統計學處理

實驗數據使用SPSS 21.0 分析。正態分布的計量資料以 表示，組間比較采用t 檢驗，多組間比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t 檢驗；非正態分布的資料用M（P25，P75）表示，癌旁組織與癌組織間比較用配對秩和檢驗。受試者操作特征（ROC）曲線和統計圖分別使用SPSS 21.0 和GraphPad Prism 8.0 繪制。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、轉移性宮頸鱗癌組織中miR-21-5p 的表達

RT-qPCR 結果顯示 ，miR-21-5p 在10 對轉移性宮頸鱗癌組織中的表達為2.426（1.697，5.753），高于癌旁組織的0.288（0.019，1.873），兩者比較差異有統計學意義（Z = 2.797，P = 0.004），見圖1。

圖1 轉移性宮頸鱗癌組織與癌旁組織中miR-21-5p 的表達水平

二、miR-21-5p 促進宮頸癌SiHa 細胞集落形成

轉 染48 h 后，mimic-21 組SiHa 細 胞 克 隆集 落 數 為585.30±29.37， 多 于mimic nc 組 的399.30±27.02（t = 8.073，P ＜0.01）；inhibitor-21組SiHa 細胞克隆集落數為269.30±16.5，少于inhibitor nc 組的393.00±23.58（t = 7.442，P ＜0.01），見圖2。

圖2 miR-21-5p 促進SiHa 細胞集落形成

三、miR-21-5p 增強宮頸癌SiHa 細胞遷移、增殖能力

Transwell 遷移實驗結晶紫染色結果顯示，mimic-21 組遷移細胞數為2233.33±155.67，較mimic nc 組 的1013.43±80.83 增 多（t = 12.047，P ＜0.001），inhibitor-21 組 的 細 胞 遷 移 數 為248.00±45.57， 較inhibitor nc 組 的1341.33±227.74 減少（t = 8.154，P ＜0.01），見圖3A、B。MTT 實 驗 結 果 顯 示， mimic-21 組 細 胞OD 值 為1.768±0.078，較mimic nc 組的0.771±0.032 升高（t = 26.473，P ＜0.001）；inhibitor-21 組細胞OD 值為0.464±0.062，較inhibitor nc 組的0.845±0.041降低（t = 11.443，P ＜0.001），見圖3C。

圖3 Transwell 檢測 miR-21-5p 對SiHa 細胞遷移能力的影響（光學顯微鏡，×100）

四、miR-21-5p 靶向調控SPYR2

設計序列（圖4A）。miRTarBase 數據庫預測發現，miR-21-5p 和SPRY2 之間存在結合位點。RT-qPCR 結果顯示，轉染后mimic-21 組miR-21-5p mRNA 表達水平為9.38±0.39，高于mimic nc組 的0.79±0.55、inhibitor-21 組 的0.82±0.05 和inhibitor nc 組的1.21±0.34，見圖4B。雙熒光素酶驗證結果顯示，共轉染MUT 基因的SPRY2 相對熒光強度在mimic-21 組為0.58±0.14，在mimic nc組為0.63±0.10，在inhibitor-21 組為 0.58±0.14，在inhibitor nc 組為0.52±0.09，4 組細胞的熒光素酶活性比較差異無統計學意義（F = 0.436，P >0.05）；共轉染WT 基因的SPRY2 相對熒光強度在inhibitor-21 組為0.50±0.08，較mimic-21 組的0.23±0.04、mimic nc 組 的0.41±0.09 和inhibitor nc 組的0.34±0.09 提高（F = 14.151，P ＜0.001），見圖4C。

圖4 miR-21-5p 靶向調控SPYR2

五、miR-21 表達變化對SiHa 細胞ERK/MAPK信號通路蛋白表達的影響

蛋白免疫印跡法檢測顯示，mimic-21 組p-MSK、p-90RSK、p-C-RAF、p-MEK 和p-MAPK蛋白表達較mimic nc 組上調，而inhibitor-21 組蛋白表達較inhibitor nc組下調（P均＜0.05），見圖5。

圖5 改變miR-21-5p 表達對各組細胞ERK/MAPKS 信號通路蛋白表達的影響

六、血清EXO 形態、標志蛋白及細胞攝取實驗

高速離心法提取血清EXO，電鏡下見所提取的囊泡大部分為類圓形或圓形，見圖6A；NTA 結果顯示，囊泡粒徑分布范圍30～150 nm，見圖6B；蛋白免疫印跡法結果顯示，囊泡中的Alix、CD9、CD63 表達均呈陽性，見圖6C。上述結果提示提取的囊泡為EXO。PKH26 標記EXO 與人臍靜脈內皮細胞共孵育24 h，免疫染色結果顯示，EXO 進入細胞內部沿核周分布，提示EXO 可以很好地被細胞攝取，見圖6D。

圖6 EXO 形態、標志蛋白及細胞攝取

七、 miR-21-5p 在轉移性宮頸鱗癌患者血清EXO 中的表達

RT-qPCR 顯示血清EXO 中miR-21-5p 相對表達量在轉移性宮頸鱗癌患者中為6.26±2.32，高于其在健康體檢者中的1.27±0.39（t = -3.670，P =0.021）。

八、血清EXO 中miR-21-5p 對宮頸鱗癌轉移的診斷價值

ROC 曲線分析顯示曲線下面積為0.9375，表明血清EXO miR-21-5p 對宮頸鱗癌轉移有較好的診斷能力（P ＜0.05），見圖7。

圖7 血清EXO miR-21-5p 預測宮頸鱗癌細胞轉移的ROC 曲線

討 論

宮頸癌的發生、轉移機制非常復雜，然而具體的分子調控機制仍有待進一步探討。miR-21-5p是一種具有癌基因特性的促癌miR，是腫瘤發生、發展中的重要調控因素，而其是否參與宮頸癌的生長及轉移尚無確切的證據。

本研究首先將miR-21-5p 的mimics 及inhibitor轉染至SiHa 細胞，通過調節miR-21-5p 的表達水平，利用集落形成實驗及MTT 比色法觀察細胞的生長、Transwell 法檢測細胞遷移能力、蛋白免疫印跡法檢測ERK/MAPK 信號通路蛋白表達的變化，結果顯示SiHa 細胞轉染mimics-21 后的生長、遷移能力增強。轉染mimics-21 后細胞生長受到抑制，遷移能力減弱。這說明miR-21-5p 可能通過促進宮頸癌細胞生長，增強遷移及侵襲能力，在宮頸癌發生、發展中發揮癌基因的作用，接著通過miRTarBase 數據庫預測miR-21-5p 可以靶向結合SPRY2 蛋白，雙熒光素酶實驗也驗證了這一點，兩者在細胞內表達呈負相關，這與既往研究結論一致。

眾所周知，MAPK 信號轉導通路在許多腫瘤細胞的生長及遷移等過程中發揮重要的調節作用［12］。ERK 信號通路被認為是經典的 MAPK 通路。其活化過程是通過Ras →Raf →MEK 通路作用于ERK，活化的ERK 作用于某些關鍵的調節因子，起到調節細胞生長、侵襲、遷移和調控細胞周期等作用［13-14］。許多miR 是通過MAPK 信號通路來發揮其功能［15］。例如，miR-378 通過抑制MAPK 信號通路中關鍵蛋白的表達，從而抑制心肌細胞增殖［16］。本研究顯示，轉染mimic-21 后，ERK 信號通路中p-RSK、p-MSK、p-RAF、p-MEK 和p-MAPK蛋白的相對表達量升高，相反轉染inhibitor-21 后，ERK 信號通路中上述蛋白的相對表達量明顯降低，與陰性對照組比較差異均有統計學意義。據此推測，改變miR-21-5p 的表達可能影響人宮頸癌SiHa 細胞的生長和遷移，其機制可能是通過調節ERK/MAPK 信號通路中關鍵蛋白的表達來實現的。

EXO 是一種具有雙層膜結構的囊泡，其內含有大量的活性物質如蛋白質和核酸［17］。EXO 可由體內多種細胞分泌，在信息傳遞方面也起著重要作用。腫瘤細胞通常比正常細胞產生更多的EXO，來源于腫瘤細胞的EXO 具有很強的能力來改變局部和遠處的微環境［10，18-19］。為 了探究miR-21-5p 是否通過EXO 的傳遞促進腫瘤細胞轉移及擴散，本研究通過RT-qPCR 檢測轉移性宮頸鱗癌患者血清EXO 中miR-21-5p 的相對表達量，發現miR-21-5p在血清EXO 的相對表達量高于健康體檢者。為進一步證明EXO miR-21-5p 在腫瘤細胞轉移中的作用，本研究繪制宮頸鱗癌患者血清EXO miR-21-5p預測腫瘤細胞轉移的ROC 曲線，曲線下面積為0.9375。因此，miR-21-5p 是促進宮頸鱗癌細胞轉移的關鍵致癌miR，而EXO 則是充當腫瘤轉移過程中信息交流的重要媒介，因此EXO 中miR-21-5p 可作為宮頸癌細胞轉移的預測因子。

本研究有兩點不足：①組織樣本量不夠大；②未使用ERK/MAPK 通路抑制劑和SPRY2 蛋白抑制劑驗證逆轉miR-21-5p 過表達對人宮頸癌細胞生長和遷移的促進效應；③未通過動物模型對miR-21-5p 在宮頸癌發生、發展中的作用進行體內研究。后續筆者團隊將通過相關實驗驗證并進一步闡明。

綜上所述，轉移性宮頸癌組織源性miR-21-5p通過EXO 的傳遞促進腫瘤轉移，其機制與靶向SPRY2 調控ERK/MAPK 信號通路的激活有關。