苦參堿調(diào)控circ_0013958/miR-532-3p軸對卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

胡柏帆 章雪蓮 黃佼 譚建福 (南華大學(xué)附屬長沙市中心醫(yī)院,湖南 長沙 410004)

苦參堿是從豆科植物苦參中提取的一種生物堿,具有鎮(zhèn)痛、解熱、減輕心肌損傷、抗肝損傷、抗腫瘤等多種藥理作用〔1,2〕。苦參堿的抗腫瘤作用主要表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,且對正常細(xì)胞的毒副作用較小,是一種具有良好發(fā)展前景的抗腫瘤藥物〔3～5〕。研究表明〔6,7〕,苦參堿能夠促進卵巢癌細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖。但苦參堿調(diào)控卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用機制尚不清楚。因此,本研究體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞,深入探討苦參堿抑制卵巢癌細(xì)胞增殖,促進細(xì)胞凋亡的作用機制,以期為苦參堿用于卵巢癌臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Hyclone 公司);青鏈霉素混合液(100×,北京Solarbio 公司);苦參堿注射液(50 mg/5 ml,廣州白云山明興制藥有限公司);TRIzol 試劑(美國Invirogen 公司);Gimsa 染色液(北京Solarbio 公司);膜聯(lián)蛋白V 異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京森貝伽生物公司);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(南京碧云天生物公司);ABI 7500 實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀(美國ABI 公司);FACSCalibur 型流式細(xì)胞儀(美國BD 公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人正常卵巢上皮細(xì)胞株ISOE80 和卵巢癌細(xì)胞株A2780、SKOV-3、OVCAR-3均購自美國ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,每2 d 更換1 次培養(yǎng)液,待細(xì)胞匯合達90%左右時,加入胰酶消化,傳代培養(yǎng)。取第3 代生長至對數(shù)期的細(xì)胞用于以下實驗。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 小干擾RNA 陰性對照(siRNA negative control)、circ_0013958 siRNA、pcDNA(+)空載體、pcDNA-circ_0013958、miRNA mimics、miR-532-3p mimics 由廣州銳博生物合成,使用Lipofectamine 3000 試劑轉(zhuǎn)染至A2780 細(xì)胞,并分別計為si-NC、sicirc_0013958、vector、circ_0013958、miR-NC 和miR-532-3p。轉(zhuǎn)染48 h 后,qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4 qRT-PCR 取生長至對數(shù)期的未轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞,加入胰蛋白酶消化,制成密度為5×104個/ml的單細(xì)胞懸液,接種于96 孔板中,分別給予苦參堿0.0、0.4、0.8、1.2 g/L 處理24 h 后,收集細(xì)胞。采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA,然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,SYBR Green 進行qRT-PCR。PCR 程序:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s,60℃退火1 min,進行35 個循環(huán)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為circ_0013958 的內(nèi)參,U6 作為miR-532-3p 的內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法檢測目的基因相對表達量。

1.5 平板克隆實驗 取生長至對數(shù)期的轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的A2780 細(xì)胞,加入胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞,用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞;將細(xì)胞懸液做梯度倍數(shù)稀釋,分別以每皿50、100、200 個細(xì)胞的梯度密度接種于培養(yǎng)皿中,以培養(yǎng)液中不添加苦參堿的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照組,以培養(yǎng)液中添加1.2 g/L 苦參堿的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為苦參堿組,轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)液中均添加1.2 g/L 苦參堿。將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 w,以肉眼可見的克隆出現(xiàn)時,終止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后,加入4%多聚甲醛固定15 min,然后加適量Gimsa 染色20 min,沖洗后,自然風(fēng)干,直接計數(shù)克隆。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 取生長至對數(shù)期的轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的A2780 細(xì)胞,加入胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞,用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml,以1 ml/皿接種于100 mm 培養(yǎng)皿中,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,更換新鮮的含有1.2 g/L苦參堿或不含苦參堿的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞,加入預(yù)冷的無水乙醇,混勻后放入4℃固定30 min或過夜,離心收集細(xì)胞,加入稀釋后的RNA 酶溶液,37℃下孵育30 min,然后加入PI 溶液室溫下避光染色30 min,流式細(xì)胞儀上機檢測,使用Modfit 軟件分析細(xì)胞周期各時相細(xì)胞百分比。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取生長至對數(shù)期的轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的A2780 細(xì)胞,消化收集,制成單細(xì)胞懸液,分別在含有1.2 g/L 苦參堿或不含苦參堿的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。離心收集細(xì)胞,加入1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,并轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至EP 管中,分別加入5 μl的Annexin V-FITC 和5 μl 的PI,混勻,避光染色15 min。流式細(xì)胞儀上機檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.8 雙熒光素酶實驗 通過circinteractome 網(wǎng)站預(yù)測到circ_0013958 與miR-532-3p 具有靶向結(jié)合位點。進一步將含有miR-532-3p 結(jié)合位點的circ_0013958 序列(circ_0013958 WT)和circ_0013958 突變序列(circ_0013958 MUT)構(gòu)建雙熒光素酶報告基因載體,然后分別與miR-NC 和miR-532-3p 共轉(zhuǎn)染A2780 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h 后,使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細(xì)胞中熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0 軟件進行LSD-t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 苦參堿對卵巢癌細(xì)胞中circ_0013958、miR-532-3p 表達的影響 與人正常卵巢上皮細(xì)胞株ISOE80(1.00±0.07)相比,卵巢癌細(xì)胞株A2780、SKOV-3、OVCAR-3 中circ_0013958 相對表達量(3.64±0.42)、(2.77±0.35)、(1.97±0.24)均明顯升高(均P＜0.05);與人正常卵巢上皮細(xì)胞株ISOE80(1.00±0.03)相比,卵巢癌細(xì)胞株A2780、SKOV-3、OVCAR-3中miR-532-3p 相對表達量(0.43±0.5)、(0.57 ±0.07)、(0.64±0.06)均明顯降低(均P＜0.05)。其中A2780 細(xì)胞中circ_0013958 和miR-532-3p 差異表達最明顯。因此選擇A2780 細(xì)胞用于后續(xù)實驗。與0.0 g/L 組比較,0.4、0.8、1.2 g/L 苦參堿處理后A2780 細(xì)胞中circ_0013958 相對表達量均顯著降低(均P＜0.05),miR-532-3p 相對表達量均顯著升高(均P＜0.05);說明不同濃度苦參堿處理A2780 細(xì)胞均能抑制細(xì)胞中circ_0013958 的表達,上調(diào)miR-532-3p 的表達,且呈濃度依賴性。見表1。選擇苦參堿濃度1.2 g/L 用于后續(xù)實驗。

表1 不同濃度苦參堿對A2780 細(xì)胞中circ_0013958、miR-532-3p 的影響(±s,n=3)

表1 不同濃度苦參堿對A2780 細(xì)胞中circ_0013958、miR-532-3p 的影響(±s,n=3)

1)與0.0 g/L 組比較,2)與0.4 g/L 組比較,3)與0.8 g/L 組比較:均P＜0.05

組別circ_0013958miR-532-3p 0.0 g/L 組0.4 g/L 組0.8 g/L 組1.00±0.051.00±0.11 0.71±0.091)1.67±0.141)0.53±0.071)2)2.08±0.221)2)1.2 g/L 組0.38±0.051)2)3)2.74±0.311)2)3)

2.2 過表達circ_0013958 逆轉(zhuǎn)苦參堿對A2780 細(xì)胞克隆和周期的影響 與對照組比較,苦參堿組細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯減少(P＜0.05);細(xì)胞周期G0/G1 期細(xì)胞百分比明顯升高(P＜0.05),S 期細(xì)胞百分比明顯降低(P＜0.05)。與苦參堿+vector 組比較,苦參堿+circ_0013958 組細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯增多(P＜0.05);細(xì)胞周期G0/G1 期細(xì)胞百分比明顯降低(P＜0.05),S 期細(xì)胞百分比明顯升高(P＜0.05)。說明苦參堿能夠抑制A2780 細(xì)胞克隆形成,阻滯細(xì)胞周期于G0/G1 期,抑制細(xì)胞分裂,從而抑制細(xì)胞增殖,而過表達circ_0013958 逆轉(zhuǎn)了苦參堿對A2780 細(xì)胞克隆形成和周期的抑制作用。見圖1、表2。

表2 各組細(xì)胞克隆形成數(shù)目和細(xì)胞周期比例比較(±s,n=3)

表2 各組細(xì)胞克隆形成數(shù)目和細(xì)胞周期比例比較(±s,n=3)

與對照組比較:1)P＜0.05;與苦參堿+vector 組比較:2)P＜0.05

組別細(xì)胞克隆形成數(shù)目(個)細(xì)胞周期百分比(%)G0/G1 期S 期G2/M期.39苦參堿組75.04±8.921)64.28±1.671)23.32±2.421)12.40±0.93苦參堿+vector 組73.67±7.4465.13±1.6121.56±1.9913.31±0.54苦參堿+circ_0013958 組119.96±9.752)57.36±2.232)30.10±3.022)對照組134.35±10.5855.40±2.5531.38±2.6413.22±0 12.54±1.22

圖1 各組細(xì)胞克隆形成和周期

2.3 過表達circ_0013958 逆轉(zhuǎn)苦參堿對細(xì)胞凋亡的影響 與對照組細(xì)胞凋亡率〔(6.14±1.38)%〕比較,苦參堿組〔(15.69±3.01)%〕明顯升高(P＜0.05)。與苦參堿+vector 組細(xì)胞凋亡率〔(16.11±3.58)%〕比較,苦參堿+circ_0013958 組〔(8.54±2.16)%〕明顯降低(P＜0.05)。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡

2.4 circ_0013958 靶向miR-532-3p 通過circinteractome 網(wǎng)站預(yù)測到circ_0013958 與miR-532-3p 具有靶向結(jié)合位點circ_0013958 MUT:5′-AGCAAAUGUUUGCCUACCCUCAG-3′、circ _0013958 WT:5′-AGCAAAUGUUUGCCUUGGGAGAG-3′、miR-532-3p:3′-ACGUUCGGAACCCACACCCUCC-5′。進一步雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果,與miR-NC 組比較,miR-532-3p 明顯抑制含有circ_0013958 WT 序列的熒光素酶活性(P＜0.05)。見圖3、表3。

圖3 結(jié)合位點圖

表3 熒光素酶活性檢測(±s,n=3)

表3 熒光素酶活性檢測(±s,n=3)

與miR-NC 組比較:1)P＜0.05

組別circ_0013958 WTcirc_0013958 MUT miR-NC 組1.00±0.011.00±0.02 miR-532-3p 組0.29±0.041)0.96±0.08

2.5 circ_0013958 負(fù)調(diào)控miR-532-3p 的表達 與vector 組比較,circ_0013958 組細(xì)胞中circ_0013958相對表達量明顯升高(P＜0.05),miR-532-3p 相對表達量明顯減低(P＜0.05);與si-NC 組比較,si-circ_0013958 組細(xì)胞中circ_0013958 相對表達量明顯降低(P＜0.05),miR-532-3p 相對表達量明顯升高(P＜0.05);說明在A2780 細(xì)胞中過表達circ_0013958能夠下調(diào)miR-532-3p 的表達,而抑制circ_0013958能夠上調(diào)miR-532-3p 的表達。見表4。

表4 circ_0013958 負(fù)調(diào)控miR-532-3p 的表達(±s,n=3)

表4 circ_0013958 負(fù)調(diào)控miR-532-3p 的表達(±s,n=3)

與vector 組比較:1)P＜0.05;與si-NC 組比較:2)P＜0.05

組別circ_0013958miR-532-3p vector 組1.00±0.111.00±0.09 circ_0013958 組7.36±0.921)0.44±0.051)si-NC 組1.01±0.070.98±0.12 si-circ_0013958 組0.26±0.042)3.88±0.462)

2.6 苦參堿通過circ_0013958/miR-532-3p 調(diào)控卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡 與苦參堿+circ_0013958+miR-NC 組比較,苦參堿+circ_0013958+miR-532-3p組細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯減少,細(xì)胞周期G0/G1 期細(xì)胞百分比明顯升高,S 期細(xì)胞百分比明顯降低,細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)。說明過表達miR-532-3p 逆轉(zhuǎn)了過表達circ_0013958 對苦參堿作用的影響。見表5。

表5 各組細(xì)胞克隆、細(xì)胞周期百分比和細(xì)胞凋亡率比較(±s,n=3)

表5 各組細(xì)胞克隆、細(xì)胞周期百分比和細(xì)胞凋亡率比較(±s,n=3)

與苦參堿+circ_0013958+miR-NC 組比較:1)P＜0.05

組別細(xì)胞克隆形成數(shù)目(個)細(xì)胞周期百分?jǐn)?shù)(%)G0/G1 期S 期G2/M 期細(xì)胞凋亡率(%).287.29±1.85苦參堿+circ_0013958+miR-532-3p 組71.69±8.241)63.94±1.761)21.23±1.9541)14.83±3.5713.01±2.241)苦參堿+circ_0013958+miR-NC 組103.77±10.8253.61±3.0828.58±2.3817.81±1

3 討 論

卵巢癌是女性生殖器惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤〔8〕。卵巢癌的主要治療方式是腫瘤切除術(shù)及輔助性化療,但因超70%卵巢癌患者確診時已屬晚期,且癌細(xì)胞易產(chǎn)生化療耐性,導(dǎo)致其復(fù)發(fā)率高,預(yù)后較差〔9,10〕。苦參堿作為一種具有臨床應(yīng)用價值的腫瘤抑制藥物受到越來越多的研究者關(guān)注。本研究結(jié)果證實,苦參堿能夠抑制卵巢癌細(xì)胞克隆形成,阻滯細(xì)胞周期于G0/G1 期,抑制細(xì)胞的增殖,且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類生物體內(nèi)廣泛存在的共價閉合環(huán)狀非編碼RNA,較線性RNA 具有更好的穩(wěn)定性,且組織特異性強〔11,12〕。研究〔13～15〕表明,circRNA 特殊的分子生物性功能尤其是miRNA 分子海綿作用,在調(diào)控惡性腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、化療敏感等方面發(fā)揮重要作用,使其成為潛在的新的腫瘤分子標(biāo)志物和分子靶向治療靶點。研究〔16〕在卵巢癌組織中發(fā)現(xiàn)7 333 個circRNA,其中2 431個circRNA 顯著上調(diào),并證實circHIPK3 調(diào)控卵巢癌細(xì)胞A2780 和SKOV3 的增殖、凋亡、遷移和侵襲。circ_0013958 是來自ACP6 基因的剪接序列長度340 bp 的circRNA,研究表明〔17,18〕,circ_0013958 在肺癌細(xì)胞中高表達可促進細(xì)胞增殖和侵襲,抑制細(xì)胞凋亡,在卵巢癌細(xì)胞中高表達可能通過影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和凋亡信號通路參與卵巢癌進展。

miRNA 分子海綿作用是circRNA 發(fā)揮其功能的主要途徑,miRNA 是一類天然存在的具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能的小分子非編碼RNA,幾乎參與了包括細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞周期、腫瘤形成、腫瘤發(fā)展等所有生物過程〔19,20〕。miR-532-3p 被發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中低表達,靶向miR-532-3p 可調(diào)控卵巢癌的進展〔21,22〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達circ_0013958 的苦參堿抑制細(xì)胞增殖、促進細(xì)胞凋亡的逆轉(zhuǎn)作用消失。提示抑制circ_0013958 表達,進而促進miR-532-3p 的表達,可能是苦參堿抑制卵巢癌細(xì)胞增殖,促進細(xì)胞凋亡的作用機制之一。

綜上,苦參堿能夠有效抑制卵巢癌細(xì)胞周期進展,抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其作用機制可能與抑制細(xì)胞中circ_0013958 的表達,進而上調(diào)miR-532-3p 的表達有關(guān)。circ_0013958/miR-532-3p 軸是苦參堿在卵巢癌中發(fā)揮抑癌作用的機制之一,但其他作用機制還有待研究。