煙酸對高膽固醇血癥大鼠NO/cGMP/cGK通路及血管內皮功能障礙的影響

王麗 王瑩 黃一聆 梁明慧 宋沛然 康文藝( 商丘醫學高等?？茖W校藥學院,河南 商丘 476000;河南大學 附屬南石醫院藥學部臨床藥學科; 藥學院天然藥物研究所)

高膽固醇血癥是引起冠心病、動脈粥樣硬化、高血壓等疾病的危險因素〔1〕,各種損傷刺激和心血管危險因素作用血管內皮細胞,導致內皮細胞損傷、功能紊亂,造成血管內皮功能障礙〔2〕。因此,治療高膽固醇血癥從緩解血管內皮功能障礙開始。煙酸作為B 族維生素,具有調節血脂功效,可降低總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平,且對血管內皮功能有一定影響〔3〕,但具體機制尚不清楚。血管的舒張和收縮又主要靠內皮細胞釋放的血管活性物質實現,最主要的活性物質是內皮衍生性舒張因子,即一氧化氮(NO),血管內皮受損會導致NO 合成分泌減少從而影響內皮功能〔4〕,NO/環磷酸鳥苷(cGMP)/cGMP 依賴性蛋白激酶(cGK)通路又是調節內皮功能的重要通路,損傷NO/cGMP/cGK 通路即損傷內皮功能,造成血管內皮功能障礙〔5〕。煙酸是否通過NO/cGMP/cGK 通路影響血管內皮功能障礙尚不明確。本文建立高膽固醇血癥大鼠模型,煙酸治療后添加NO 合酶(NOS)抑制劑觀察其對NO/cGMP/cGK 通路的影響,為煙酸的治療機制提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康SD 大鼠,SPF 級、體重(210±10)g,均購自北京維通利華實驗動物科技有限公司〔許可證號:SCXK(京)-2018-0103〕。在河南大學附屬南石醫院實驗動物中心溫度(24±1)℃、濕度(55±5)%、光照、黑暗各12 h,通風良好的環境中自由飲水攝食,暫養1 w 后進行實驗。本研究均經河南大學附屬南石醫院動物實驗倫理委員會審核并批準。

1.2 試劑 煙酸(北京市永康藥業有限公司,批準文號:國藥準字H11020595);L-NMMA(總NOS 抑制劑)、NOS 試劑盒(碧云天科技有限公司,貨號:S0011、S0025);TC、TG 酶法測定試劑盒(廣州東林生物科技有限公司, 批號分別為: 粵械注準20181300160、粵械注準20172400942);高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、LDL-C 試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司,批號分別為:2018-66-8、2019-05-6);NO 測定試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司,批號:20190361);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海生工生物技術公司,貨號:E607318);一抗兔抗鼠磷酸化血管擴張刺激磷蛋白(p-VASP)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH),二抗羊抗兔(英國abcam 公司,貨號分別為:ab109541、ab181602、ab6721)。

1.3 動物分組及給藥處理 基礎飼料配方:魚肝油、骨粉、鹽、酵母粉各1%,豆粉10%、麥麩15%、面粉35%、玉米面36%。高脂飼料配方:膽酸鈉0.5%、豬油5%、蛋黃粉10%、基礎飼料85%。大鼠隨機分為對照組、模型組、煙酸組、煙酸+NOS 抑制劑組,每組8 只。除對照組采用基礎飼料飼養外,其余各組高脂飼料連續飼養4 w,建立高膽固醇血癥大鼠模型〔6〕,煙酸組根據人與動物等效計量換算法〔7〕灌胃150 mg/kg 煙酸〔8〕,煙酸+NOS 抑制劑組灌胃150 mg/kg 煙酸+0.5 g/kg L-NMMA〔9〕,煙酸和L-NMMA 均溶解至飲用水中灌胃,對照組和模型組灌胃等體積飲用水,1 次/d,連續4 w。

1.4 樣品采集 實驗結束后大鼠禁食12 h,靜脈取血,取各組腹主動脈樣本部分置于4%多聚甲醛中固定,部分置于-80℃冰箱保存待用。

1.5 體重水平檢測 實驗前、高脂飼料處理4 w后、藥物處理4 w 后稱量各組大鼠體重。

1.6 血脂水平檢測 靜脈血室溫放置2 h,3 000 r/min離心10 min,取上清為血清置于新的離心管中,氧化酶法測定TC、TG 水平,免疫比濁法測定HDL-C、LDL-C 水平。

1.7 血管內皮功能檢測 硝酸還原酶法檢測血清中NO 水平,酶促反應法檢測血清中NOS 水平。

1.8 HE 染色觀察大鼠腹主動脈形態學變化 腹主動脈經4%多聚甲醛中固定后制備常規石蠟切片,切片脫蠟后HE 復染,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察腹主動脈形態學情況。

1.9 Western 印跡檢測大鼠腹主動脈組織中磷酸化血管擴張刺激磷蛋白(p-VASP)水平 -80℃冰箱中取部分腹主動脈組織,加入蛋白裂解液冰上研磨,4℃13 400 r/min 離心20 min,上清即為總蛋白。凝膠電泳分離后轉膜,5%脫脂奶粉封閉;加入一抗p-VASP、GAPDH,4℃孵育過夜;加入對應二抗,室溫孵育1 h。凝膠成像系統對條帶進行灰度分析。

1.10 統計學方法 采用GraphPad8.0 統計學軟件進行單因素方差分析、q檢驗。

2 結 果

2.1 煙酸對大鼠體重水平的影響 實驗前,各組體重差異無統計學意義(P＞0.05)。高脂飼料處理4 w后,與對照組相比,模型組、煙酸組、煙酸+NOS 抑制劑組體重顯著升高(P＜0.05)。藥物處理4 w 后,與對照組相比,模型組體重顯著升高(P＜0.05);與模型組相比,煙酸組體重顯著降低(P＜0.05);與煙酸組相比,煙酸+NOS 抑制劑組體重顯著升高(P＜0.05)。與對照組相比,模型組血清中NO、NOS 水平顯著降低(P＜0.05);與模型組相比,煙酸組血清中NO、NOS 水平升高,差異具有統計學意義(P＜0.05);與煙酸組相比,煙酸+NOS 抑制劑組血清中NO、NOS 水平降低,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 4 組實驗前、干預4 w 后體重及血清中NO、NOS 水平比較(±s,n=8)

表1 4 組實驗前、干預4 w 后體重及血清中NO、NOS 水平比較(±s,n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與煙酸組比較:3)P＜0.05;表2 同

組別實驗前體重(g)高脂飼料處理4 w 后體重(g) 藥物處理4 w 后體重(g)NO(μmol/L)NOS(U/ml)2±3.1582.36±5.18模型組208.59±6.87434.15±12.151)468.18±15.191)19.92±2.321)63.45±6.081)煙酸組211.31±7.45433.19±13.491)405.48±13.422)36.56±4.682)78.18±3.152)煙酸+NOS 抑制劑組209.96±5.18434.69±13.191)427.27±16.993)21.33±3.423)52.48±4.583)F/P 值0.254/0.858128.235/0.00046.185/0.00038.對照組209.78±5.16316.15±15.69389.16±10.5529.1 798/0.00063.801/0.000

2.2 煙酸對大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 及腹主動脈組織p-VASP 水平的影響 與對照組相比,模型組血清中TC、TG、LDL-C 水平顯著升高,HDL-C 及腹主動脈組織p-VASP 水平顯著降低(P＜0.05);與模型組相比,煙酸組血清中TC、TG、LDL-C水平降低,HDL-C 及腹主動脈組織p-VASP 水平顯著升高(P＜0.05);與煙酸組相比,煙酸+NOS 抑制劑組血清中TC、TG、LDL-C 水平顯著升高,HDL-C及腹主動脈組織p-VASP 水平顯著降低(P＜0.05)。見表2、圖1。

表2 4 組血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平及腹主動脈組織p-VASP 水平比較(±s,n=8,mmol/L)

表2 4 組血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平及腹主動脈組織p-VASP 水平比較(±s,n=8,mmol/L)

組別TCTGHDL-CLDL-Cp-VASP對照組1.39±0.190.44±0.050.42±0.030.24±0.040.86±0.06模型組1.81±0.161)0.76±0.111)0.31±0.041)0.36±0.041)0.13±0.021)煙酸組1.28±0.182)0.51±0.042)0.43±0.042)0.25±0.032)0.57±0.042)煙酸+NOS 抑制劑組1.63±0.153)0.69±0.063)0.35±0.033)0.34±0.043)0.29±0.043)F/P 值15.595/0.00036.310/0.00021.067/0.00021.099/0.000459.074/0.000

圖1 4 組腹主動脈組織中p-VASP 蛋白水平

2.3 煙酸對大鼠腹主動脈組織形態學的影響 對照組腹主動脈內膜光滑、平整,內皮細胞扁平狀且排列規則,細胞核排列均勻;模型組腹主動脈內膜凹凸不平,細胞膜破裂,細胞核出現明顯散落,部分細胞出現大面積與基底膜脫離現象;煙酸組細胞核排列整齊,細胞核散落現象不明顯;煙酸+NOS 抑制劑組相較于煙酸組,細胞核散落明顯。見圖2。

圖2 4 組腹主動脈形態學變化(HE 染色,×200)

3 討 論

高膽固醇血癥促進血管內皮功能障礙,促進動脈粥樣硬化,加重血管類疾病發生〔10〕。本研究提示,高膽固醇血癥中持久的高脂飼料造成動物血脂異常,造成肥胖,肥胖會促進血管內皮功能下降,造成腹主動脈血管內皮細胞核散落,細胞出現大面積與基底膜脫離嚴重,誘發血管內皮功能障礙〔11〕。目前一旦發現高膽固醇血癥應控制飲食,增加身體活動;在治療上以他汀藥物為首選,使用劑量由低劑量到高劑量,若不能滿足要求,則采用聯合用藥方式治療〔12〕。煙酸作為聯合使用藥物,在體內可以轉化為煙酰胺,添加煙酸可降低輔酶A 水平,從而抑制環磷酸腺苷的形成和脂肪的分解,降低血液中游離的脂肪酸和甘油含量,降低血清中TC、TG 濃度;同時可以抑制LDL-C 的合成從而降低膽固醇的轉運過程且能保持HDL-C 結構和功能〔13〕。本研究提示,煙酸可通過抑制環磷酸腺苷的形成和脂肪的分解,從而降低血液中游離脂肪酸和甘油含量,在降低TC、TG、LDL-C 的同時維持HDL-C 水平,緩解血脂水平,從而緩解肥胖,達到治療疾病目的。

NO 作為體內信號分子,前體是L-精氨酸,NO生成后激活可溶性鳥苷酸環化酶,在鳥苷酸環化酶作用下,三磷酸鳥苷生成大量cGMP,從而激活cGK,促使肌球蛋白輕鏈去磷酸化,并降低細胞內游離鈣離子水平,從而導致收縮蛋白和鈣離子結合減少,導致平滑肌松弛,血管擴張〔14,15〕。在高膽固醇血癥中NO 水平降低導致血管內皮功能障礙〔16〕。NO 是由3 種NOS〔內皮(e)NOS、神經型(n)NOS、誘生型(i)NOS〕催化L-精氨酸生成,L-NMMA 作為NOS 總抑制劑,可競爭性抑制NOS 結合位點,從而降低NOS 水平,導致血管內皮功能障礙〔17〕。p-VASP 是肌動蛋白相關的多功能蛋白,能直接或間接與單體或肌動蛋白絲結合,從而促進肌動蛋白絲的成核、成束和延長,作為血管內皮損傷中NO/cGMP/cGK 通路的重要標志,血管內皮損傷中血管微觀穩定受到破壞,p-VASP 影響血管穩定〔18,19〕。NOS 激活通過上調p-VASP 可以促進細胞的遷移和轉運過程〔20〕。本研究提示,高膽固醇血癥中NOS水平降低可以減少L-精氨酸的生成,從而降低NO的合成,降低cGMP、cGK 水平,降低細胞內游離鈣離子水平,從而導致收縮蛋白和鈣離子結合減少,導致平滑肌松弛,血管擴張,體現在蛋白表達水平上表現為p-VASP 水平降低,血管穩定性受到影響,血管微觀受到破壞,造成血管內皮功能障礙。煙酸可緩解高膽固醇血癥大鼠上述癥狀,促進NO、NOS 水平,從而維持血管內皮穩定。煙酸+NOS 抑制劑可逆轉煙酸緩解的大鼠癥狀,降低NOS 水平,從而降低p-VASP 蛋白表達,影響血管穩定,造成血管內皮功能障礙。NOS 抑制劑可逆轉煙酸對NO/cGMP/cGK 通路的激活作用,證明煙酸通過激活NO/cGMP/cGK 通路發揮作用。

綜上所述,煙酸可激活NO/cGMP/cGK 通路實現對高膽固醇血癥血管內皮功能障礙的緩解作用,從而實現對疾病的治療。本文首次驗證煙酸治療高膽固醇血癥的信號通路是NO/cGMP/cGK 通路,但煙酸作為輔助治療藥物,對疾病的耐藥性的影響是否影響藥效需進一步驗證。