蠟塊脫鈣法在常規病理技術制片中對組織染色效果及切片優良率的價值

林秋月 黃漢興 吳海燕

（福建省莆田市第一醫院，福建 莆田 351100）

隨著生物學和醫學的不斷發展，切片技術通過不斷優化改進而逐漸完善起來。現代切片技術不僅是病理檢驗技術中不可缺少的構成部分，而且已經成為生物形態學微觀結構研究的一個重要方向。病理技術制片主要過程有取材、固定、脫水、包埋、切片、染色和封固。其中切片為關鍵點，切片質量直接會影響檢驗準確性。在常規病理技術制片中，經常出現一些經過處理的蠟塊，如骨組織脫鈣不全、小灶或者灶狀鈣化灶等。骨組織是一種堅硬的結締組織，采取常規方法極容易發生脫鈣不全狀況，導致切片存在切痕明顯、染色不均勻、切片不完整等情況，直接影響切片優良率，影響診斷效果。所以需要積極采取有效方法，促使能夠全面去除鈣質，保證染色效果和切片優良率。蠟塊脫鈣法利用脫鈣液透過石蠟，能夠有效清除骨組織和鈣化灶、砂礫體內鈣質，并且不會溶解石蠟。蠟塊脫鈣法具有較高安全性，并且操作簡單，過程中不用換脫鈣液。有學者認為，蠟塊脫鈣法在常規病理技術制片中能夠保證組織染色效果，保證切片優良率[1]。鑒于此，此次研究則分析蠟塊脫鈣法在常規病理技術制片中對組織染色效果及切片優良率的價值，詳細內容見下文。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2020年6月至2021年6月接收的100塊脫鈣不足、鈣化灶以及砂礫體的蠟塊按照隨機數字表方式進行分組，50塊采取常規脫鈣法，設定為對照組，50塊采取蠟塊脫鈣法，設定為觀察組，分析兩組方法產生的效果差異。此次研究儀器和設備：全自動脫水機、全自動石蠟包埋機、輪轉式石蠟切片機、全自動染色、全自動封片機。脫鈣液配置：甲醛30 mL，甲酸20 mL，鹽酸30 mL，蒸餾水20 mL。把甲醛、甲酸以及鹽酸依次加入到蒸餾水中，搖勻混合。本研究不違反國家法律法規，符合醫學倫理原則。

1.2 方法 將接收的100塊脫鈣不足、鈣化灶以及砂礫體的蠟塊按照隨機數字表方式分組，50塊采取常規脫鈣法，作為對照組；50塊采取蠟塊脫鈣法，作為觀察組。對照組直接將蠟塊進行切片處理。觀察組將蠟塊上多余的蠟清理干凈，然后將蠟塊最大面顯露出來，放置脫鈣液里，和脫鈣液有效接觸，1 h后取出來后，清除依附的脫鈣液。兩組切片后，利用全自動染色機染色等操作，再利用顯微鏡觀察。

1.3 觀察指標 ①脫鈣終點判斷：以蠟塊組織面鈣化部分全面顯露，能夠切出完整的切片。②切片染色判斷：光學顯微鏡下細胞核，細胞質著色清晰、層次分明、紅藍適度，則判定為染色滿意。③切片質量判斷：切片外觀完整、平整、未發現空洞、厚薄均勻判斷未組織結構完整。④切片優良率判斷：10分（切片完整，貼片合適）；20分（切片厚度均勻，無污染）；30分（無固縮、龜裂碳化細胞核）；10分（封膠適當，玻片整潔）；10分（未發現皺褶）；10分（無刀痕）；5分（號碼清晰，字體端正）。分值界為80分，80分以上為優，60～80分為良好，60分以下為差。優良率=（優+良）例數/總例數×100%。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料采用（）表示，組間比較行t檢驗；計數資料采用[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 分析兩組蠟塊切片優良率 觀察組切片優良率明顯較高，P＜0.05，差異有統計學意義。見表1。

表1 兩組蠟塊切片優良率比較[n（%）]

2.2 分析兩組組織結構 對照組蠟塊切片后組織結構多數存在殘缺現象，只有29塊較完整，完整率58.00%。觀察組蠟塊切片后組織結構完整有48塊，完整率高達96.00%。觀察組蠟塊切片后組織結構完整率較高，差異有統計學意義（χ2=40.768，P=0.001）。

2.3 分析兩組染色情況和染色滿意度 觀察組經過脫鈣法脫鈣后制作的切片細胞核呈藍色，細胞質呈紅色，鈣化灶呈現藍色，沙礫體呈現紫紅色，染色均一，效果滿意度。觀察組染色不均一。觀察組染色滿度94.00%，對照組染色滿意度80.00%。觀察組染色情況較好，染色滿意度較高，差異有統計學意義（χ2=8.665，P=0.003）。

3 討論

隨著醫療水平的不斷提高，生物染色技術不斷更新和發展。采取組織切片染色方法，能夠反映不同的細胞結構和形態以及成分之間的變化[2]。組織制片及組織染色技術在醫療科學領域里占有重要地位，是教學、醫學和科研中不可缺少的一個組成部分。組織學切片所需的組織，除一部分可取自人體外（如外科手術活檢組織或尸檢的新鮮材料），大部均取自動物。其過程包括組織（細胞）取材、固定、包埋、切片、染色、封片。取材是制作切片程序中關鍵步驟。取材不當會直接影響患者病理診斷和科研工作效果。組織標本的選用極其重要[2]。隨意的切取組織制作組織切片，病理檢驗效果往往無法達到滿意評價。常規病理技術制片步驟為：首先的取材，選擇的材料越新鮮越好。人體組織和機體分離，動物組織死亡后立即固定，保證原始形態的結構[3]。選擇的材料大小要按照相關規定標準進行，促使固定液能夠快速并且平均深入到組織中。由于不同材料生產目的也有所不同，組織體積也會不同。外部病理檢查和科學研究過程中，組織大小可以縮小0.1 cm左右，這樣能夠縮短脫水實踐和透明度。設計教學切片可以厚度保持在0.3～0.5 cm，這樣以便于制作更多的學習板。采取切割物品時候需要保證鋒利度，切割時不能將組織夾太緊，不然會擠壓引起組織和細胞損壞。選擇的材料需要保證根據自然解剖位置，不同病理部位進行準確采擇。最后根據每個器官組織形態，生長結構進行切割。縱向和橫截面一般指示組織形狀和結構，如長管的器官需要橫向。保持組織原始狀態，新的組織會在一定程度上變化，可能會變多可能會變少，所以需要保證盡量保證組織原始狀態。固定中小塊組織固定方法是最常見并且也是經常應用的方法。在機體或者動物的體內采取的小組織需要及時置入液體固定劑里。樣品和固溶液的比例為1:（4～20）。組織塊不能太厚不能太大，不然會導致熔體無法迅速滲出。注射、灌注固定方法，在一些較難穿透的固定液或者組織過大，動物全部器官或者身體必須作為整體固定。利用這種方法，能夠將固定流體全部注射到血管中，并分散到組織和機體，達到完全固定的效果[4]。蒸汽固定方法是利用于太小，太厚的組織樣品中。脫水意思是樣品固定和洗滌后，組織中剩余水量較多，需要更換組織中水平。為確保能夠有效去除水平，采取石蠟和膠水。含水織物和石蠟，焦纖維黏合劑和其他包裝材料不容，脫氫是不同濃度的乙醇。丙醇也是脫水劑，也具有較高的脫水能力。但是脫水能力較高，對組織也有較顯著的影響。在教學中一般不采用這種方法。浸蠟、包埋意思是石蠟浸入組織中，取代組織中含有的透明劑。將浸蠟后的組織置于融化的固體石蠟中，石蠟凝固后，組織即被包在其中。切片是根據組織尺寸，從組織邊緣切下殘余蠟，不然會導致組織收縮。將修復后的蠟塊安置在金屬或者木蠟框架上，將切割刀片安裝在切割臺中，擰緊固定螺釘，避免在此過程中振動。保持適當厚度，做好切割機厚度調節，根據需要選擇厚度。利用鑷子提起蠟條，放置在40～45 ℃水中。在水張力和溫度作用下，蠟條會輕微起皺，自然光滑。在恒溫水面，將圓盤鋪平后，將蠟塊移到玻璃載片中段，將剩下的水倒在玻璃載片上，放置在60～65 ℃的恒溫箱內進行烘烤30 min，去蠟。染色和封片，在染色過程中，首先應保證各種試劑的濃度、體積，避免有沉淀[5]。用Harris蘇木精液時，染色前要先用一張濾紙除去液體表面的結晶，以免污染切片。脫蠟徹底，不然易出現嗜堿性片狀模糊，毛玻璃樣現象，染色不均。嚴格控制乙醇梯度時間，以免水分過快進入細胞，破壞細胞結構，影響染色效果。切片脫水后，進行二甲苯時發生白色不透明情況，脫水不完全，需要及時更換乙醇。重新徹底脫水與透明。脫水完全的切片十分干凈，透亮，有利于觀察。封片樹膠濃度盡量適當，太稀，易出現大氣泡，影響觀片效果。樣本的質量取決于初始處理的準確性和效率，包括固定、脫水、插入等。選擇所需的工具類型和適當的工具。此外，操作員的豐富經驗對切片質量保證至關重要。操作員需要熟悉切片機的工作原理，消除常見錯誤并消除一些潛在影響因素[6]。

骨髓里存在較多骨髓細胞，可以激發各種血細胞到血液。骨組織中有較多鈣化細胞和間質和數種細胞構成，鈣化細胞間質又為骨基質，骨基質有機和無機成分能夠有效融合，導致骨質十分堅硬，無法直接切割。脫鈣不全切片容易被撕碎，損壞切片。在進行病理切片時，骨組織存在較多鈣鹽沉積，而結締組織又十分堅硬，導致切片較困難。因此我們首先要清除鈣化灶鈣質里面的鈣鹽，保證組織能夠變軟，然后才能有效切片。當前，在常規病理制片技術工作中，尋找一種理想脫鈣方法，不僅要保證切片染色效果，還要保證組織結構不能被破壞，完整保證組織抗原和超微結構保存完好，是當前病理技術重點解決問題。當前多數病理實驗室采取的傳統組織塊脫鈣方法，主要是采取材料固定后組織塊放入到稀釋溶液中進行脫鈣，由于所用脫鈣液種類不一樣，所需要的鈣時間也不一樣，一般需要4～7 d，在不同程度上影響了對骨組織診斷和研究，并且還存在拖延制片時間問題，嚴重影響報告發放，嚴重影響患者診斷效果。在常規的病理制片過程中，時常會發現骨組織鈣化不足、淋巴結組織鈣化等情況，如果不進行處理，直接切片，則無法保證切片優良 率[7-8]。即使制作為切片，也會出現切片偏厚，存在明顯刀痕，染色不均勻等情況，這樣會直接影響切片優良率和組織診斷時間。采取蠟塊脫鈣法，即將蠟塊上多余的蠟清理干凈，然后將蠟塊最大面顯露出來，再將蠟塊放入已經配制好的脫鈣液中。將蠟塊底部組織面和脫鈣液直接接觸，60 min后取出，利用自來水充分清除蠟塊上的脫鈣液。采取全自動染色機自動染色、脫水、透明，中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察。蠟塊脫鈣法能夠保證蠟塊組織結構完整性，提高染色滿意率和蠟塊切片合格率。蠟塊脫鈣法采取的脫鈣液能夠透過石蠟、有效去除骨組織和鈣化灶和沙礫機體內鈣質而不溶解石蠟。蠟塊脫鈣法在整個脫鈣過程中時間較短，只需要30～60 min，這樣能夠有效提高工作效率，同時又能夠很大程度提高切片優良率，滿足病理診斷。蠟塊脫鈣法優勢較多，如安全可靠、操作簡單等，是骨組織脫鈣不足有效的彌補方法。有研究將脫鈣液進行脫鈣，將選擇好的組織塊放入到脫鈣液中稀釋脫鈣，脫鈣時間不僅長，且不同的脫鈣液具有不同的脫鈣時間，至少需要2 d，最長也需要7 d時間才能脫鈣，這樣對骨組織研究具有較大的影響，還會出現脫鈣不足、鈣化灶、砂礫體等狀況。如果直接切片，還會導致切片合格率不高，染色不均等狀況，導致診斷準確性嚴重受到影響。蠟塊脫鈣法在常規病理技術制片中效果十分明顯，能夠保證組織結構完整性，不會出現切片痕跡，并且切片染色均勻，能夠提高診斷準確性。蠟塊脫鈣法能夠促使骨組織鈣質徹底被清除掉，并且在脫鈣過程中可以不用更換脫鈣液。除外，脫鈣時間較短，能夠有效提高工作效率。此次研究則分析蠟塊脫鈣法在常規病理技術制片中對組織染色效果及切片優良率的價值。結果發現，對照組蠟塊切片后組織結構多數存在殘缺現象，只有29塊較完整，完整率58.00%。觀察組蠟塊切片后組織結構完整有48塊，完整率高達96.00%。觀察組蠟塊切片后組織結構完整率較高，差異有統計學意義（P＜0.05）。通過分析兩組切片完整率能夠直接反映，采取蠟塊脫鈣法能夠有效保證切片組織完整性，保證組織結構完整性，使其減少切片損壞等情況。觀察組經過脫鈣法脫鈣后制作的切片細胞核呈藍色，細胞質呈紅色，鈣化灶呈現藍色，沙礫體呈現紫紅色，染色均一，效果滿意度。觀察組染色不均一。觀察組染色滿度94.00%，對照組染色滿意度80.00%，觀察組染色情況較好，染色滿意度較高，差異有統計學意義（P＜0.05）為。通過分析兩組染色情況和染色滿意度能夠直接反映采取蠟塊脫鈣法染色情況較好，染色滿意評價較高。蠟塊脫鈣法能夠促使切片細胞核呈藍色，細胞質呈紅色，鈣化灶呈現藍色，沙礫體呈現紫紅色，保證染色均勻，從而符合染色要求，達到染色滿意目的。對照組切片優良率為84%，觀察組切片優良率為98%。觀察組切片優良率明顯較高，差異有統計學意義（P＜0.05）為。通過分析兩組切片優良率能夠直接反映采取脫鈣法脫鈣后切片優良率較高，且安全可靠。脫鈣法脫鈣在常規病理技術制片中具有重要意義。在制片過程中為保證制片優良率，需要注意的點較多。組織染色前必須要完全脫蠟，脫蠟不完全會直接影響染色。染色時間和新老染色制備液存一定關系。新型制備染液染色能力高，染色時間可相應縮短。注意封固的樹膠濃度要適當，不能產生氣泡。樹膠較稀，會冒出，并且還會散發。樹膠太濃，不容易擴散，不容易排出，封固以后，還容易影響切片。染色后注意細胞染色平坦。如果分層不夠深，會直接影響觀察。切片從深藍色到紅色到粉紅色，注意顏色變化。切片要及時放置水中，避免分化。取材組織塊時，盡量避免擠壓損傷。對典型或者具有教學和科研價值的標本，不能因取材導致對標本造成認為病變。腸黏膜組織上沾有少量的糞便，也不能用手擦拭或者用水洗凈。切緣組織塊應該盡量避免彎曲扭轉。取組織應該在病灶和正常組織交界處。組織形狀最佳方形或者長方形狀，這樣以便于制片。組織厚度需要均勻[9]。組織塊厚度影響固定速度，如果組織厚度不均勻，在脫水時則會引起標本變形，影響制片。組織內鈣化病灶或者骨質，需要充分固定后進行脫鈣處理，組織內非病理性物應予以清除[10-11]。

綜上所述，蠟塊脫鈣法在常規病理技術制片中對組織染色效果及切片優良率具有較高的價值，值得重視并采納。