兩種精子優化處理方法對體外受精-胚胎移植結局的影響

王惠潔 余秋鋒 高松城 黃智勇 葉秀云

（1 韶關市婦幼保健院，廣東 韶關 512000；2 翁源縣婦幼保健院，廣東 翁源 512600）

體外受精-胚胎移植技術（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）即俗稱的“試管嬰兒”，是現階段對于不孕不育治療的一個重要方式，對于不孕不育患者來講是個福音。精液優化處理是該項技術中的一個重要環節，其目的是將精液中的精漿分離出，將其他有害物質、死精子、畸形精子、細胞碎片去除，進而將一定數量成熟，同時存在受精潛能的前線運動精子優選出來[1]。現階段，臨床以密度梯度離心法、上游法等為常用的兩種優選方式。本中心在2019年前，IVF-ET周期中用于精液優化處理的方法大多為梯度離心合并上游法。自2019年始，我中心才大規模的增加單純上游法用于精液處理方法。于是將我中心2019—2021年標準人群IVF-ET第一周期人群，不同精液處理方法胚胎結局的進行如下比較。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2021年12月我院輔助生殖治療IVF標準患者結局進行研究。本研究不違反國家法律法規，符合醫學倫理原則。促排方案選擇：長效長方案，減少促排卵方案對結局的影響。納入標準：IVF-ET第一周期；女方年齡＜35歲；確定移植日內膜≥7 mm，獲卵數為5～15個。排除標準：男方處理后精子濃度＜3.0×106/L；子宮肌瘤肌瘤、畸形等形態異常；女方存在全身性疾病。妊娠判斷標準：胚胎移植后28～35 d超聲提示宮內探及孕囊回聲為臨床妊娠。本研究課題時間較長，納入周期可統持續妊娠率，活產率還未完全出齊。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 男方禁欲2～7 d后經手淫法收集精液，根據WHO人類精子檢測手冊（第5版）記錄精子體積、性狀、pH值、濃度、活力等；女性患者則實施促排卵方案，在體內的卵泡發育成熟后對其進行人絨毛促性腺激素注射，劑量為10 000 U或5 000 U，35～36 h 后，通過陰道超聲的引導下實施卵泡穿刺取卵。

1.3.2 精液處理方法 ①上游法：將收集液化完全精液緩慢注入含有3.0 mL Plus-IVF液體的10 mL規格試管底部，45 ℃靜置15～20 min，之后緩慢吸取最上層液體0.4 mL于5 mL小試管，放入培養箱待用。②密度梯度合并上游法：將收集液化完全精液緩慢滴入盛有由PremGad配成1.5 mL 40%、1.5 mL 80%梯度液離心管的上方，離心300 g，15 min。將離心后沉淀加入盛有1.5 mL Plus-IVF液體5 mL小試管中混勻。離心 300 g，3 min，棄上清。沿管壁緩慢滴入1.0 mL plus-IVF放入37 ℃培養箱上游15 min，之后吸取最上層液體0.4 mL液體至小試管中。

1.3.3 體外受精、陪同培養和移植 在取卵后4 h左右，在存在卵子的培養皿中加入經過優化處理過的精子，對精子濃度合理調整，在35.5 ℃、5%的CO2培養箱中進行為期16～20 h的培養后，顆粒進行機械法脫掉，對受精情況進行觀察，第3日對卵裂情況進行觀察，同時進行準確記錄，對胚胎進行評分后進行胚胎冷凍或胚胎移植。

1.3 觀察指標

1.3.1 胚胎結局 對比兩組患者正常受精率、優胚率、多PN率、可用胚胎囊胚形成率、正常卵裂率、可用囊胚形成率、妊娠率、著床率、流產率、持續妊娠率。

1.3.2 胚胎的評分標準 按照細胞數、細胞大小是否均勻、多少碎片等情況評價卵裂期胚胎質量。見表1。

表1 胚胎的評分標準

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料采用（）表示，組間比較行t檢驗；計數資料采用[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同分組周期一般情況比較 回顧分析2019年 1月至2021年12月符合試驗條件：男方處理后精子濃度≥3.0×106/L 35歲以內、獲卵5～15個、內膜≥ 7 mm、IVF-ET第一周期的助孕移植的女性患者，不同精液處理前一般情況：上游法、梯度離心合并上游法分組的患者中年齡、血清抗苗勒管激素、Gn時間、Gn總數、子宮內膜厚度、獲卵數均無差別（P＞0.05）。見表2。

表2 不同精液處理方法一般資料比較（）

表2 不同精液處理方法一般資料比較（）

注：各組方差均齊，使用方差分析，P＞0.05，兩組樣本來自同一標準人群。

2.2 兩組精液處理法胚胎結局比較 經一般資料比較發現，上游法和梯度離心合并上游法具有樣本選擇的隨機性、同質性。接下來進行正常受精率、正常卵裂率、優胚率、可用胚胎囊胚形成率、可用囊胚形成率、著床率、妊娠率、流產率、持續妊娠率的比較。兩種精液處理方法在優胚率方面差異有統計學意義（P＜0.05）。上游法優胚率45.85%大于梯度離心法40.42%。兩種精液處理方法在正常受精率、多PN率、正常卵裂率、可用胚胎囊胚形成率、可用囊胚形成率、著床率、妊娠率、流產率、持續妊娠率差異均無統計學意義（P＞0.05）。但上游法可用囊胚形成率高于梯度離心法4.01%、上游法著床率高于梯度離心法3.02%、上游法妊娠率高于梯度離心法4.04%、上游法持續妊娠率高于梯度離心法4.71%，而流產率上游法比梯度離心法低1.64%。可能由于樣本量少，沒有統計學意義，并不代表沒有實際差別。見表3。

表3 兩種精液處理對胚胎結局比較

3 討論

人工方法在輔助生殖技術中將染色質完整性好、核成熟度、形態正常、活力好的精子是IVF-ET取得成功的關鍵因素。處理精液的目的是將精漿中的碎片、畸形精子、抗精子抗體、細菌、免疫活性細胞、死亡精子、前列腺素等其他有害物質。這可能對精子的活力或其受精能力產生影響或抑制，引起子宮痙攣，還可能對卵細胞產生損傷，對于早期胚胎發育產生組織作用。將精漿除去的目的是因為精漿可能將艾滋病等傳染性疾病風險去除；將精液的黏稠性減少；達到合乎要求的活動精子密度；對精子獲能促進，對精子受精能力改善。但因為精漿存在對精子功能保護的主要抗氧化物質，將精漿去除的同時也會導致精子的氧化應激損傷，使DNA斷裂的概率增加。有學者指出，精液處理技術應用期間的反復離心會使活性氧類物質顯著增加，引起精子出現氧化應激性DNA損傷，利用該類精子實施ART治療，會降低妊娠率、受精率，同時易引起反復的自然流暢[2]。理想的精子分離技術需要包括如下幾點：①操作簡單、費用低、快速。②獲得多量活動精子。③不損傷精子或分離后的精子并沒有出現生理性改變。④盡量將其他細胞和死精子去除，包括細菌、白細胞。⑤去除ROS或其他活性物質或有毒的物質。⑥可以對多體積的精液處理。但是現有的技術對于全部的要求常常不能滿足，現階段臨床以密度梯度離心法、上游法為臨床常用方法。上游法的原理：活動精子能經過液界面而到不同的培養液中，可以使精子與無用物質自行分離而重新分布，無用物質包括其他有害成分、凝集精子、雜質、畸形精子、活力差的精子、白細胞、死精子、雜質。但是該種方法獲得了高質量的精子，但是存在較低的精子回收率。有學者指出，上游法優選出的精子存在很好的運動參數，活率也較高，但是對于完整精子頂體的比例并不能提升[3]。而上游法可得到很多的存在完整頂體區域的橢圓形精子[4]。上游法也可以不成熟以及染色體異常的精子，同時也有學者指出，用精子染色質結構分析法的過程中檢測了Percoll梯度離心法和上游法對精子優選，都獲得了正常形態、活動良好的精子，但是后者可以將精子DNA完整性提升，但是前者卻不能[5]。同Ixa Prep梯度離心法、Pure Sperm相比，上游法可以將一氧化氮產量有效降低，前者可以將精子的運動特性，繼而將其作為精子毒物，是因為鳥苷酸環化酶的激活使cGMP的產生增加，且該物質會對精子的運動性產生抑制作用。密度梯度離心法的原理：采取密度梯度不同液體放在試管中，保證其無毒、無菌，試管底部為密度最大者，依次向上遞減，表面密度最小，則構成了不連續的密度梯度，在密度最底層的上方放置液化后的精液，離心后，所需要的活動力強的精子在試管最底部[6]。同上游法對比，密度梯度離心法對于更多形態正常的精子可以得到，會顯著增加精子的活力、體外生存能力，特別是那些畸形精子癥狀、弱精癥、少精癥等存在更高的因回收率，此法更加合適。Percoll梯度離心法在優選精子中的歷史已經超過20年，該種方式不但簡便，同時存在較高的活動精子回收率。但是Percoll液中存在PVP可導致女性生殖道內膜乃至腹膜出現炎性反應，美國自1996年起，該種方式只在試驗室中應用，對于臨床中禁用，之后便將不含PVP的替代液Pure Sperm等開發出來[7]。Pure Sperm離心法同Percoll離心法存在的優選精子的效果相近，同時對于精子來勁并沒有毒性作用[8]。有研究報道，密度梯度離心法可以將染色體濃縮差、DNA斷裂的精子分離出來[9]。有學者認為，密度梯度離心法對異常精子處理后，獲得的精子的低滲腫脹試驗陽性率、頂體反應率同成熟的精子比例同上游法相比更佳[10]。

上述很多的研究結果都不同，可能同進行優選處理的精子樣本質量存在聯系。而本中心摸索出的上游法+密度梯度離心法是以傳統的密度梯度離心法為基礎采取了不含離心操作的上游過程，在理論上，將兩種精子處理方法的優點結合在一起；精子存在加工的回收率，同時可以二次對回收的精子篩選，同時對于損傷精子DNA的程度并不增加，進而確保了用于受精的精子的質量。本文分析我中心2019—2021年IVFET周期標準患者472例，比較不同精液處理方法對標準人群胚胎結局的差別。通過上游法與梯度離心合并上游法胚胎結局的比較發現，上游法在優胚率方面有統計學優勢，在可用囊胚形成率、著床率、妊娠率、持續妊娠率均有數據優勢；在流產率方面數據也是最低。分析原因可能是梯度離心合并上游法可以篩選核成熟的精子，但是經過離心又增加了氧化應激，造成DNA斷裂損傷，染色質交聯異常，影響精子受精后胚胎結局；也可能是樣本量不夠大，沒有得出統計差別，今后研究繼續增加樣本量，繼而獲得更加準確的研究結果。

總而言之，對于精子的處理方法可以結合臨床的具體情況進行優化處理，進而獲得更加優質的精子，提升妊娠率，改善妊娠結局。