構建組織工程人工角膜的天然生物材料的研究進展

陳 娜，石 棟，趙江月

0引言

角膜是位于眼球前部外層的一層透明結構，保護眼球不受環境影響并提供三分之二的屈光力，是視覺系統重要的組成部分。角膜疾病或損傷可能會導致嚴重的視力障礙甚至失明。角膜由前向后分為5層，依次是上皮細胞層、前彈力層、基質層、后彈力層和內皮細胞層[1]。角膜是無血管組織，組成簡單但排列卻非常規則，從而保證其良好的透光性及屈光性。在我國，角膜疾病是僅次于白內障的第二大致盲性眼病[2]。對此最有效的治療手段是角膜移植手術，主要有三種類型：(1)穿透性角膜移植術；(2)前板層角膜移植術；(3)內皮角膜移植術[3]。穿透性角膜移植術是以全層透明角膜代替全層混濁角膜。前板層角膜移植術和內皮角膜移植術的主要優點是保留了未受影響的健康角膜組織，同時替換了受損的部分，從而降低了同種異體角膜移植排斥反應[3]。由于供體角膜的嚴重短缺以及免疫排斥等問題，迫切需要進行組織工程角膜研發和促進天然角膜組織再生的研究。

組織工程角膜是由種子細胞、支架材料及其調控微環境組成[4]。當細胞分化成特定的角膜結構并生長到足夠面積時，可以被植入以取代損傷或缺失的角膜。植入后的支架可充當細胞外基質(extracellular matrix ,ECM)替代物，直到種子細胞生長成能夠發揮功能的融合組織[5]。適合的支架材料至少需要具備以下三點：(1)該材料本身透明或者移植到眼內后變為透明。(2)良好的生物相容性，既能作為細胞載體適合其貼附生長及增殖，又具有較低的免疫排斥性從而提高手術成功率。(3)一定的機械強度，能夠耐受手術中的縫合或黏合操作。由于角膜主要有三個不同的細胞層，每一層有其獨特的結構和細胞類型，這對設計適合修復或替換的支架材料提出了不同的挑戰。本文就目前組織工程角膜最為常用的天然生物支架材料的應用進展及價值進行綜述。

1常用于組織工程人工角膜的天然生物材料

1.1羊膜羊膜(amniotic membrane，AM)是胎膜的最內層，是孕期圍繞和保護胎兒的結構。因兼具透明性以及低免疫原性，使其可以很好地應用于眼表，并成為支撐角膜上皮細胞生長、遷移和黏附的極好底物[6]。但未經處理的羊膜缺乏完全透明性和填補大缺損所需的機械強度，容易在處理時發生折疊或者縫合時撕裂；在結構和ECM的成分上也可能存在供體間的差異性。因而我們討論了羊膜的應用范圍以及改善方法。

1.1.1羊膜在角膜組織再生中的臨床應用在因角膜緣干細胞缺乏癥(corneal limbal stem cell deficiency，LSCD)導致的角膜上皮缺損中，患者的眼表缺乏可以通過分化和遷移來修復損傷的干細胞群。此時羊膜可作為培養上皮細胞或角膜緣干細胞的良好支架材料，用以體外培養形成復層上皮層后進行移植。Eslani等[7]對60例嚴重化學燒傷眼患者進行隨機對照臨床試驗。試驗組(30例)接受藥物治療和羊膜移植，對照組(30例)為傳統藥物治療，隨訪至少12mo。結果顯示，兩組病例在角膜上皮化完成時間、最佳矯正視力和角膜中央5mm內新生血管生成三個方面的結果均無統計學意義[7]。而Basu等[8]對125例因眼表燒傷而患上單側LSCD的患者，進行自體單純角膜緣上皮移植后的長期臨床效果觀察。該移植方式是用纖維蛋白膠將羊膜上皮側向上固定在角膜缺損處，再取健眼的角膜緣外植體切成小塊，用纖維蛋白膠以上皮側向上呈圓形排列固定在羊膜上。結果顯示，在術后平均隨訪1.5(1～4)a中，有95眼成功保持了穩定的再生角膜表面，沒有進行性結膜化、持續性上皮缺損、感染或需要重復移植等問題，且最佳矯正視力有顯著改善[8]。兩項研究表明，使用羊膜治療伴有LSCD的上皮缺損時，羊膜與細胞結合能產生更好的結果。同時羊膜是角膜修復、再生和組織工程中的一種可行的材料，并可以通過對其進行改良以達到更好地應用效果。

1.1.2提高羊膜透明度和強度的方法提高羊膜透明度和強度的一種常用方法是化學交聯法，即使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)使蛋白質結構中的伯胺與羧酸發生交聯，從而穩定蛋白質的結構，增加材料的機械強度。Hariya等[9]將復層的八層羊膜干燥后再交聯，不僅大幅度增加材料的強度和厚度，同時提高了多層羊膜的透明度，使其成為修復角膜較大缺損的可行選擇。觀察其在兔眼的移植效果時發現，角膜重新上皮化，并能抵抗膠原酶的降解且無新生血管生成[9]。

Che等[10]通過膠原酶Ⅳ消化去上皮羊膜的基質部分產生超薄羊膜(ultra-thin amniotic membrane，UAM)，將角膜基質細胞(corneal stromal cells，CSCs)培養在多層UAM之間，然后植入兔模型中觀察。結果顯示，四層UAM-CSC在培養8wk后可達到人角膜厚度的一半，顯示出良好的透明度，且移植物很好地整合到受體角膜中，實現完全上皮化，無肌成纖維細胞分化[10]。該方法較好地復制了角膜基質組織，能夠促進角膜基質樣組織的體外發展，為基礎研究和治療潛力開辟了新的途徑。

1.1.3羊膜在角膜內皮組織工程中的應用目前臨床上尚未將羊膜用于內皮缺損的患者。趙君等[11]以非轉染人角膜內皮單克隆細胞株細胞作為種子細胞，以去上皮羊膜為載體支架，體外構建出組織工程人角膜內皮，采用內皮角膜移植手術將其移植到獼猴右眼。術后觀察到體外構建的組織工程角膜內皮透明度高，具有與活體角膜內皮相近的形態結構；且移植眼角膜能夠維持透明，沒有出現明顯的炎癥和免疫排斥反應，有望用于角膜內皮異常疾病的臨床治療[11]。

1.2脫細胞角膜脫細胞角膜的主要優點是具有ECM的物理結構和機械強度，因而具備適當的光學性能和角膜功能。同時它能直接還原細胞生長的三維環境，從而促進細胞遷移、增殖與分化[12]。但該材料仍存在局限性：(1)供體角膜的數量問題；(2)某些脫細胞方法在一定程度會破壞ECM組成，可能會導致材料的變化；(3)供體之間的個體差異，也可能導致材料在ECM的組成和結構上不一致。目前，已有大量研究比較不同來源的角膜以及不同的脫細胞方法來應對這些限制。

1.2.1脫細胞角膜的來源脫細胞豬角膜(acellular porcine corneal stromata，APCs)因其結構、大小與人角膜相似且數量更豐富，已廣泛用作組織工程移植材料的研究。研究人員將各種細胞如角膜上皮細胞、角膜基質細胞、口腔黏膜上皮細胞、由胚胎干細胞誘導分化的角膜上皮樣細胞及內皮樣細胞等培養在APCs上，然后移植到動物模型中觀察[13-16]。結果表明，單純移植APCs時，角膜往往混濁、水腫，常有新生血管形成。反之，當結合一種細胞時，角膜清晰，水腫消退快，厚度可恢復正常[13-16]。這與使用羊膜觀察到的結果相似，即材料中結合細胞對角膜恢復透明有益，使用單一材料可能不足以修復角膜損傷。

與豬角膜相比，鴕鳥角膜的解剖結構更接近人角膜，且后者在脫細胞前后的力學性能(包括彈性、黏度和最大靜態張力)無顯著差異[17]。Liu等[17]將脫細胞鴕鳥角膜基質(acellular ostrich corneal stroma，AOCs)與APCs分別進行兔板層角膜移植術。在術后6mo AOCs顯示出更高的透明度[17]。

人脫細胞角膜的免疫排斥反應較異種組織更低。小切口角膜基質透鏡取出術(small incision lenticule extraction, SMILE)衍生出的人透鏡材料成為修復基質缺損或組織工程角膜替代材料的新選擇[18]。Bhandari等[19]對7例7眼角膜微穿孔、部分厚度缺損、外傷性角膜撕裂患者，使用纖維蛋白膠將透鏡固定在受損眼中。結果顯示，術后15d視力明顯提高；3mo后，所有的移植物對位良好且保持清晰[19]。當角膜缺損較大時單獨使用透鏡材料會導致移植物脫落，Abd Elaziz等[20]對7例角膜穿孔較大患者采用縫合透鏡結合羊膜覆蓋的方式。術后8wk左右，部分透鏡成功結合到角膜基質中，覆蓋的羊膜可發生再上皮化[20]。但在1a的隨訪中，雖然所有病例沒有發生排斥反應，但觀察到角膜瘢痕形成和致密的角膜血管化[20]。兩項臨床研究的結果表明，移植基質透鏡是一種安全、有效且易于獲得的，用于治療角膜小穿孔的替代方案。它提供了一個穩定的支架用以促進角膜傷口愈合。但該方法的應用限制是它只能用于小缺損，無法修復或更換完整的角膜。

1.2.2角膜脫細胞的方法許多方法可以使角膜脫細胞，包括氯化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、TritonX-100、胰蛋白酶-EDTA、高靜水壓、伽瑪輻照、氨基酸表面活性劑等[21-26]。此外，上述方法經常同時使用核酸酶去除細胞物質如DNA和RNA。將這些方法適當地結合互補則可以適用于大多數臨床應用中，可以達到脫細胞的最終目標，即完全脫細胞和去核的同時，最大限度保持所需的ECM結構、組織和功能特性等[27]。

1.3膠原材料角膜基質層的主要成分是膠原，約占干重的71%，主要為Ⅰ型膠原，其余為Ⅲ型和Ⅳ型膠原[28]。目前市面上已有多種不同純化形式的各型膠原可供購買。純化膠原作支架的優勢在于可以更好地控制材料的性能、消除不同來源材料間的變異性。但是膠原材料缺乏縫合和處理所需的機械強度，且未經處理時是半透明而非完全透明狀態。因此大多數研究都集中在提高其強度和透明度上，并通過物理或添加其他生物活性分子的方式來修飾膠原材料，以此提高其性能。

1.3.1Ⅰ型膠原提高Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ，COLⅠ)水凝膠強度和透明度的第一種方法是去除水分，增加聚合物鏈相互作用。主要有塑化壓縮和玻璃化的方式[29-31]。其中塑化壓縮有重物壓力法和3D RAFTs法(real architecture for 3D tissue)[29-30]。塑化壓縮方法得到的凝膠均薄而透明且已證明比未壓縮水凝膠更能促進角膜緣上皮細胞的生長[29-30]。COLⅠ玻璃化是指緩慢干燥COLⅠ水凝膠，直到它成為一個清晰的、硬的玻璃狀膜，稱為玻璃化凝膠，是替換羊膜的一種可行選擇[31]。

第二種常用方法是交聯。該方法包括戊二醛、Genipin、碳化二亞胺類(如EDC/NHS)和UV交聯[32-33]。最常見且最理想的方法是EDC/NHS，這與前面討論用其交聯羊膜是相同的方法。Koulikovska等[32]在兔角膜基質缺損模型中，已證明上皮干細胞和基質干細胞都能在交聯COLⅠ上生長，且移植材料8wk內保持透明，沒有炎癥表現。此外，遷移的宿主細胞在移植物內能夠產生新的膠原，這也是證明基質組織再生的直接組織化學證據[32]。

通過EDC/NHS交聯的一個獨特優勢是在交聯過程中COLⅠ可以與其他生物分子(如檸檬酸或萬古霉素)結合而提升功能性[33-34]。結合檸檬酸后的交聯COLⅠ抵抗膠原酶消化的能力大大增強，從而降低了移植的失敗率[33]。與萬古霉素的結合，則是創造了一種抗菌材料[34]。在角膜移植術后，既降低了感染風險，又解決了患者術后使用抗生素滴眼液依從性差的問題[34]。

最近Zhao等[35]將金納米粒子(Au nanoparticles，AuNPs)和mircoRNA-133b (miR-133b)的納米復合物引入COLⅠ中，利用miR-133b抑制體外肌纖維細胞轉變的能力，實現了對角膜基質層的修復和瘢痕抑制的作用。行兔前板層角膜移植后觀察，角膜維持透明未出現混濁，組織結構與健康角膜相似[35]。因此，COLⅠ結合AuNPs/miR-133b復合物可以快速修復角膜，有效地抑制瘢痕形成[35]。

研究中使用的COLⅠ來源豐富，物種上有牛、大鼠、豬等，起源組織有皮膚、尾巴等。這些組織來源的差異可能會對COLⅠ材料的物理和生物特性產生影響[36-37]。因此還需要更多研究探索出合適且穩定的組織工程膠原材料。

1.3.2重組人Ⅲ型膠原重組人Ⅲ型膠原(recombinant human collagen Ⅲ，rhCOLⅢ)與COLⅠ的結構不同，它對膠原酶具有更強的抵抗力[28]。可用于膠原酶過度表達導致的眼表不穩定患者。Fagerholm等[38]證明經EDC/NHS交聯后的rhCOLⅢ作組織工程角膜支架，與同種情況下的COLⅠ具有相似的機械特性并能維持角膜的清晰，但前者具有更好的光學特性。植入人眼并進行4a的隨訪發現，組織工程角膜融合到患者角膜中且未受到排斥和免疫抑制[38]。此外，部分植入物已被細胞浸潤后重塑，更接近天然基質[38]。最近一項研究中，M?lzer等[39]發現將rhCOLⅢ與2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine，MPC)結合，能夠誘導樹突狀細胞的凋亡，從而避免了激活T細胞帶來的纖維化和免疫排斥反應。

然而COLⅢ材料的機械強度難以承受移植手術中的縫合操作[38]。同時，很大一部分紫外光線可通過該材料而損害眼內結構，這意味著患者在上皮層愈合前，必須避光[38]。此外，rhCOLⅢ的免疫原性隨凝膠的性質和組成而不同,建議對水凝膠免疫原性/纖維原性潛力進行臨床前評估[39]。

1.4蠶絲絲素蛋白(silk fibroin，SF)由蠶繭產生，具有良好的生物相容性且是已經FDA批準使用的生物材料，廣泛應用于組織工程、再生醫學和藥物輸送[40]。蠶絲膜具有可調控的生物降解性和光學特性[41]。在構建組織工程角膜時，最大的優勢是可以被塑造出各種形狀和微圖案，從而控制細胞生長和ECM產生的方向[41]。由于它是異種材料并且缺乏特定的細胞結合序列[41]，目前的研究主要集中在增加其細胞附著能力以及優化絲支架的結構[42-45]

1.4.1增加絲膜的細胞附著的方法(1)利用EDC/NHS將細胞黏附肽序列RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)交聯到缺乏RGD序列的蠶絲中[42]。Ghezzi等[42]將七層經RGD修飾的多孔絲膜正交堆疊形成一個三維支架；然后將人角膜基質干細胞和人角膜成纖維細胞分別培養在支架上。9wk后兩種細胞在支架上的生長良好、排列規則并產生ECM且保持透明[42]。(2)將親和素非共價地吸附到蠶絲膜表面，再通過親和素-生物素相互作用，將生物素-RGD結合到絲膜-親和素上，從而使絲膜獲得結合細胞的能力[43]。該方法比化學交聯法更好地保留絲膜的功能性，同時可通過改變吸附參數控制絲膜表面親和素的釋放[43]。(3)用蛋白質修飾絲膜支架[44-45]。如支架表面的COLⅠ溶液涂層足以增加兔內皮細胞的附著和增殖[44]。或者在澆鑄絲膜前，在蠶絲溶液中加入蘆薈凝膠，獲得的混合薄膜更透明，而且提高了角膜內皮細胞的活力，在材料上形成完整的單層[45]。(4)用非桑蠶(如Antheraea assamensis)生產的含有天然RGD序列的絲，該絲可以直接使用[46-47]。該品種的絲膜營養滲透性高、機械強度高，并支持角膜上皮外植體、角膜緣干細胞等多種角膜的細胞生長[46-47]。通過兔板層角膜移植術，觀察到該絲膜未引起炎癥反應或新生血管生成，同時促進角膜上皮化、使其透明度和表面完整性得以恢復[47]。該絲膜材料的優勢在于不需要額外的復雜修飾，但對于非桑蠶絲和常用桑蠶絲材料的物理性質和細胞反應的比較仍需進一步研究。

1.4.2絲膜的圖案化可將絲溶液澆鑄到凹槽型PDMS模具上，塑成具有各種圖案的微槽膜[48-50]。Lawrence等[48]已證明平行線形圖案的絲膜比同心環形圖案、無圖案或玻璃化絲膜，更適合培養角膜緣上皮干細胞。Bhattacharjee等[49]發現，相比于無圖案絲膜上，角膜細胞生長方向的隨機性；圖案化絲膜包括平行線形、正交形等的角膜細胞則沿圖案的方向遷移生長。Zhang等[50]構建了一種仿生3D角膜，將角膜細胞培養在經COLⅠ修飾并且具有3%的穹頂形應變的平行線圖案絲膜支架上，以模擬天然角膜的曲率和機械應變。從而確定了用于細胞排列和維持角膜細胞表型的最佳底物平行線形的行距[50]。

2構建組織工程角膜的天然生物材料比較

回顧之前討論過的每種生物材料及其處理方法在用于組織工程角膜方面的不同的優點和局限性見表1。

表1 構建組織工程人工角膜的天然生物材料的主要優勢和局限性的比較

3總結與展望

目前，還沒有單一的生物材料可以成功應用于角膜全層，這表明有關組織工程角膜的研究仍存在突破點。由于大多數研究是在健康角膜中進行，因而需要更多的研究來評估其在疾病和損傷模型的表現。由于角膜有三個不同的細胞層，單一的材料不太可能被用來設計一個完整的角膜全層移植物，因此，不同材料和方法的組合或許能為組織工程角膜的研究提供潛在的方向。此外，組織工程角膜相關的文獻也明確指出細胞的存在是至關重要的。角膜上皮細胞及基質細胞均有干細胞群，已經可以成熟穩定地培養[4, 51-52]。但是內皮細胞缺乏干細胞群，且原代細胞難以在體外擴增和培養。為了解決這一問題，有研究了胚胎干細胞和誘導多能干細胞分化作為為角膜內皮樣細胞的方法[16, 53-54]。雖然已經有一些成功的報道，但可以用于臨床移植所需成熟的角膜內皮細胞系的來源仍有待研究。組織工程人工角膜作為用于移植的替代物，其成功的構建取決于兩方面的創新，即支架材料和結合在材料上的種子細胞，并且只有將兩者成功地結合才可能構建出合適的具有功能性的組織材料。