突變型KRAS在胰腺導管腺癌代謝中的作用

陳 懿，謝 黎，吳 健，2，3

1復旦大學基礎醫學院病原生物學系，教育部/衛健委醫學分子病毒重點實驗室，上海 200032；2復旦大學附屬中山醫院消化科，上海 200032；3上海市肝病研究所上海 200032；4復旦大學上海醫學院臨床醫學院，上海 200032

胰腺癌是一種侵襲力強、致死率高的惡性腫瘤，由于其發病隱匿，進展迅速，預后不良，胰腺癌在癌癥相關死亡原因中位居前列。2021年中國國家癌癥中心統計數據顯示，胰腺癌位居我國男性惡性腫瘤發病率第7位，女性第11位，占惡性腫瘤相關死亡率第6位。2021年美國統計數據顯示，在所有惡性腫瘤中，胰腺癌新發病例男性居第10位，女性居第8位；死亡率在男性、女性中均位居第4位。2020年，美國有57 600例新發胰腺癌病例，其中47 050例死亡［1］。胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是最常見的胰腺癌類型，2018年數據顯示，PDAC患者的5年生存率僅為9%［2］。目前，手術切除仍是治療胰腺癌的唯一方法，但只有20%患者符合指征而接受外科手術，即使手術成功切除者，超過80%患者最終仍會發生局部復發或轉移［3］。近期，一線化療手段在提高PDAC患者生存率方面取得重要突破，然而二線或后期治療中仍然缺乏高效的治療方案。此外，作為治療癌癥的新興策略，使用檢查點抑制劑的單一療法對PDAC幾乎完全無效［4］，這主要是由PDAC免疫抑制腫瘤微環境所致。綜上所述，針對PDAC的治療需尋求新突破。

腫瘤代謝相關的基因突變被認為是胰腺癌進展和預后不良的基礎。KRAS致癌突變是胰腺癌中最常見的基因突變，超過90%PDAC患者可檢測出KRAS突變［5］。KRAS突變損害蛋白內在三磷酸鳥苷（GTP）酶活性，阻止其從活性形式GTP向非活性形式二磷酸鳥苷（GDP）的轉化，使KRAS蛋白始終與GTP結合而被永久激活，并作為分子開關激活下游多種細胞內信號通路和轉錄因子，誘導細胞增殖、遷移、轉化和存活。本文將重點介紹由突變型KRAS介導的腫瘤代謝改變在胰腺癌發生和進展中的作用，以及靶向KRAS治療策略的研究現狀與前景。

1 PDAC的腫瘤代謝特點

不同類型腫瘤代謝差異顯著，這是由特定的基因突變、組織來源或腫瘤微環境決定的。PDAC腫瘤微環境的特點是缺氧、低營養水平、高間質壓力和結締組織增生。其腫瘤微環境富含致密纖維，主要由細胞外基質（如膠原蛋白和透明質酸）組成［6］。除了透明質酸、細胞因子、趨化因子和多種膠原蛋白外，PDAC的腫瘤微環境中還包含多種細胞成分，如巨噬細胞、樹突細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞［7］。局部免疫抑制為腫瘤發生、進展以及遠處轉移提供了理想環境。

以CD4＋調節性T淋巴細胞為主的“冷”腫瘤通常會逃避免疫系統；致密結締組織增生阻礙了治療藥物的局部攝取。致密間質壓迫血管，使得血管形成受阻，灌注不足，導致腫瘤內嚴重持續缺氧［8］。但PDAC細胞卻能在供氧不足、營養匱乏的條件下展現出非凡的生長優勢，這依賴于其獨特的代謝途徑：（1）對細胞內營養物質的能量代謝進行重編程，包括葡萄糖、氨基酸和脂質；（2）通過清除和循環利用來改善養分的攝取；（3）與微環境中的其他成分交聯互通，進行代謝調控。而在不利微環境下的適應性突變（或選擇）則是腫瘤生存的關鍵。KRAS高突變發生率促使人們探討其對胰腺癌侵襲性、轉移性及代謝重編程的影響。

2 KRAS基因及其編碼蛋白的功能

KRAS基因編碼蛋白質KRAS，一種小GTP酶。它通過偶聯細胞膜生長因子受體與細胞內信號通路和轉錄因子，充當多種細胞過程的“分子開關”。KRAS蛋白含有兩個功能域：G結構域和細胞膜錨定域，G結構域參與結合和水解GTP，細胞膜錨定域C端由CAAX基序構成，這一結構對膜錨定作用很重要。KRAS與GTP結合時被激活，與GDP結合時失活。一旦KRAS蛋白與GTP結合，它會與下游80多個效應蛋白和信號通路相互作用，包括絲裂原活化蛋白激酶－MAPK激酶通路（MAPK－MEK通路）、磷脂酰肌醇3激酶－蛋白激酶B－雷帕霉素靶蛋白通路（PI3K－AKT－mTOR通路）、加速性纖維肉瘤－MAPK激酶－細胞外調節蛋白激酶通路（RAF－MEK－ERK通路）等。核轉錄因子如ELK、JUN和MYC也會被激活，進而刺激細胞分化、增殖、遷移、轉化、黏附和存活［9－10］。

KRAS基因第12位密碼子上的激活點突變是大部分胰腺癌病例（70%～95%）的起始事件，其中KRASG12D較為常見。KRAS的點突變破壞了RAS的內在GTP酶活性，使GTP酶活化蛋白（GAP）失去對GTP的失活作用（即促進GTP向GDP轉化），因此KRAS蛋白與GTP永久結合，持續激活下游信號通路，維持細胞存活和增殖［10］（圖1）。

圖1 KRAS信號通路及其對細胞功能的作用Figure 1 KRAS signaling pathway and its effects on cell function

3 KRAS突變與PDAC腫瘤代謝

PDAC腫瘤微環境表現為缺氧、低營養水平、高間質壓力和結締組織增生。為了在這種惡劣微環境中生存，PDAC腫瘤細胞改變代謝通路，參與葡萄糖、氨基酸、脂質代謝的重編程；利用溶酶體清除途徑，如細胞自噬和巨胞飲作用（macropinocytosis），獲取生存生長的“燃料”，支持、維護代謝穩態；PDAC的腫瘤微環境中多種細胞成分，如癌癥相關成纖維細胞（cancer－associated fibroblasts，CAF）、神經元和免疫細胞，在營養限制的條件下支撐PDAC的生長［11］。

在PDAC中，致癌突變型KRAS與葡萄糖攝取增加、轉向合成代謝途徑分流、谷氨酰胺重編程以及活性氧（ROS）調控有關［12］。此外，為了解決營養稀缺或供應不平衡，致癌突變型KRAS激活獨特的代謝清除途徑。2020年的研究［9，13］表明，在PDAC小鼠模型中，致癌突變型KRAS通過上調細胞因子，促進免疫細胞浸潤，重新編程PDAC腫瘤代謝。

3.1 PDAC腫瘤細胞代謝重編程

3.1.1 糖代謝 Warburg效應是腫瘤細胞代謝的共同特征，表現為葡萄糖攝取增加，線粒體氧化磷酸化轉變為有氧糖酵解。這種代謝變化有利于癌細胞在惡劣環境（缺氧、營養缺乏）中存活生長。突變型KRAS通過調節細胞代謝通路參與這一過程。

突變型KRAS通過增加葡萄糖轉運體、糖代謝關鍵酶（如Hk1、Hk2、Pfk1、Ldha）、己糖胺生物合成途徑（hexosamine biosynthesis pathway，HBP）的限速酶谷氨酰胺6－磷酸果糖轉移酶以及非氧化性磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）中5－磷酸核丁糖異構酶和5－磷酸核丁糖－3－差向異構酶的表達，提高葡萄糖攝取和乳酸產量，從而促進糖酵解通量。其機制在于突變型KRAS可持續激活下游MAPK信號通路與轉錄因子Myc，在轉錄水平調節上述基因的表達［14］。己糖激酶1、己糖激酶2、磷酸果糖激酶1以及乳酸脫氫酶A作為糖酵解的限速酶，這些酶類的編碼基因表達上調有助于增強Warburg效應和糖酵解過程。HBP作為葡萄糖代謝的分支途徑，為蛋白質和脂質糖基化提供了底物，這一代謝途徑的增強被認為是腫瘤進展的關鍵。除了調控糖酵解外，突變的KRAS刺激磷酸甘油酸激酶1向線粒體易位，導致癌細胞中丙酮酸脫氫酶激酶1（PDHK1）磷酸化，磷酸化PDHK1抑制丙酮酸脫氫酶（PDH）復合物，抑制PDAC細胞中線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）［15］（圖2）。

圖2 KRAS突變影響胰腺導管腺癌代謝重編程Figure 2 KRAS mutation affects metabolic reprogramming in pancreatic ductal adenocarcinoma

3.1.2 脂代謝 脂質代謝在癌癥進展中有著至關重要的作用。與依賴膳食脂肪的正常細胞不同，腫瘤細胞中約93%的三酰甘油脂肪酸是由線粒體內檸檬酸（線粒體內乙酰輔酶A與胞質內乙酰輔酶A之間的中間體）從頭合成。致癌突變型KRAS可誘導腫瘤細胞從胞外溶血磷脂攝取單不飽和脂肪酸，PDAC的缺氧腫瘤微環境對這一過程也有促進作用。此外，致癌突變型KRAS可調節激素敏感性脂肪酶，進而調控胰腺癌細胞的脂質儲存［16］。

近期研究［17］顯示，酰基輔酶A合成酶長鏈3（ACSL3）在KRAS驅動的胰腺癌中過度表達。ACSL3將細胞外不飽和脂肪酸轉化為無法出胞的親水性脂肪酰基輔酶A酯（hydrophilic fatty acyl－CoA esters），從而促進細胞外不飽和脂肪酸的活化和保存［18］。在胰腺癌的小鼠模型中，敲除基因ACSL3降低腫瘤細胞增殖，部分原因是抑制了纖溶酶原激活物抑制劑－1的生成，進而減弱了腫瘤微環境中結締組織增生和免疫抑制［17］。瑞士伯爾尼大學的一項新近研究（2022年）［19］表明，通過限制血脂或抑制ACSL3來消耗細胞外來源的脂質會觸發細胞自噬，這一過程保護PDAC腫瘤細胞避免生物能中間體的損耗。細胞外脂質供應在PDAC腫瘤細胞的脂肪酸供應中占據核心地位，發現這一腫瘤細胞代謝脆弱性對PDAC的治療有著指導意義。

3.1.3 氨基酸代謝 突變型KRAS對腫瘤細胞氨基酸代謝發揮調節作用。谷氨酰胺代謝作為氮和碳的主要來源，有助于大分子合成和氧化還原平衡，對癌細胞的生存至關重要。在PDAC中，致癌突變型KRAS誘導磷酸戊糖途徑的代謝重組，從而使5－磷酸核糖的生物合成與NADPH的生成解耦聯。這種代謝改變促使癌細胞嗜谷氨酰胺。為滿足對NADPH的需求，KRAS通過轉錄抑制谷氨酸脫氫酶、誘導天冬氨酸轉氨酶的表達來促進谷氨酰胺的代謝，維持腫瘤生長和存活。其中，線粒體各氨酰胺來源的天冬氨酸（Asp）一旦被轉運到細胞質，就會轉化為草酰乙酸、蘋果酸，最終成為丙酮酸以生成NADPH，從而平衡細胞氧化還原穩態與大分子合成。此外，由共激活因子相關精氨酸甲基轉移酶1誘導的蘋果酸脫氫酶1精氨酸甲基化能抑制腫瘤生長，但KRAS的激活可以解除這一抑制，保持癌細胞的活力，促進細胞增殖［20］。

如前所述，線粒體各氨酰胺來源的Asp必須被轉運到細胞質中才能進行后續的轉化，因此負責轉運過程的線粒體蛋白至關重要。線粒體解耦連蛋白2（UCP2）催化Asp的轉運并促進腫瘤的生長。研究顯示，UCP2沉默的KRASmut細胞系谷氨酰胺分解減少，NADPH/NADP＋比值降低，活性氧水平升高。體內與體外實驗都表明，UCP2基因沉默強烈抑制了KRAS突變型PDAC腫瘤細胞的生長［21］。UCP2以其Asp轉運活性連接線粒體與細胞質反應，為致癌突變型KRAS誘導的谷氨酰胺代謝重組所必需，因此它也被視為PDAC治療的關鍵代謝靶點。

3.2 腫瘤細胞的巨胞飲與自噬作用 巨胞飲作用是一種營養清除途徑，是細胞通過內吞作用大量攝取細胞外液獲得營養的過程，已被確認為營養限制條件下維持PDAC生存、生長的重要機制［22］。PDAC腫瘤細胞可通過巨胞飲作用從細胞外液中攝取細胞外蛋白（如血清白蛋白），蛋白隨后被溶酶體降解，為中心碳代謝供應氨基酸。可見，巨胞飲作用對維持PDAC腫瘤細胞的氨基酸供應有著重要作用。突變型KRAS與腫瘤細胞表面的αvβ3和半乳糖凝集素3（galectin－3）形成復合物，促進癌細胞的巨胞飲作用；這一復合物也維持胰腺癌細胞的氧化還原平衡。

已有研究［23］表明，致癌性RAS誘導巨胞飲作用需要多種效應因子如PI3K信號通路、小GTP酶（Rac1、Cdc42）的活性，液泡ATP酶（V－ATPase）則是RAS依賴的巨胞飲作用的關鍵效應因子。研究顯示，致癌突變型KRAS通過蛋白激酶A和Rac1的活性促進V－ATPase向質膜易位。

自噬是將細胞質成分運送至溶酶體進行降解的過程，它降解細胞內大分子和細胞器，循環利用細胞內生物能成分，對于維持PDAC晚期階段的生存穩態和生長至關重要。因此，它在維持腫瘤中的能量穩態、提供代謝燃料起著關鍵作用。此外，自噬通過控制活性氧的產生、維持OXPHOS來促進胰腺癌的進展，升高的活性氧水平也會反過來促進胰腺癌細胞的自噬作用，這一過程受到KRAS的調節［24］。

自噬在維持PDAC免疫抑制環境中也發揮重要作用。突變型KRAS呈持續活化狀態，激活yes相關蛋白（YAP）－TAZ途徑及其下游Janus激酶信號轉導和轉錄激活因子3（JAKSTAT3）信號轉導，通過葡萄糖代謝重編程誘導細胞自噬相關的MHC－I降解［25－26］。研究［27］發現，PDAC腫瘤細胞缺乏細胞角蛋白－19的表達，細胞表面MHC－1表達降低；而在肝轉移灶內MHC－I陰性的PDAC細胞中，自噬相關基因表達非常豐富。PDAC腫瘤細胞表面的MHC－I經NBR1介導的自噬－溶酶體途徑減少［26］，因此可以通過抑制自噬來恢復癌細胞表面的MHC－I表達水平，從而增強抗腫瘤T淋巴細胞反應，抑制腫瘤生長。

鐵死亡是一種鐵依賴的非凋亡性細胞死亡形式，其敏感性可作為腫瘤細胞抵抗死亡，適應性生長的機制。KRAS突變型PDAC細胞對鐵死亡誘導較敏感，鐵死亡的PDAC細胞可通過自噬介導的外泌體分泌釋放KRASG12D蛋白，引起巨噬細胞向M2型極化并分泌免疫抑制因子，促進PDAC的發生和進展［28］。表1總結了KRAS突變對PDAC的全方位影響，特別是代謝重編程、巨胞飲與自噬作用，有助于理解這一關鍵信號通路對PDAC癌細胞侵襲、轉移、耐藥特性的作用。

表1 KRAS突變對PDAC代謝的影響Table 1 Effects of KRASmutations on PDAC metabolism

3.3 PDAC腫瘤微環境 PDAC腫瘤微環境具有高度異質性，包含腫瘤細胞、細胞外基質和基質細胞。腫瘤細胞被由膠原網組成的增生組織緊密包繞，形成缺氧、營養匱乏的惡劣環境。

CAF是促進腫瘤增殖、遷移、侵襲和轉移的關鍵因素，它主要來源于胰腺星狀細胞（pancreatic stellate cells，PSC），受到KRAS突變影響［29］。CAF能夠調節腫瘤免疫微環境，影響抗腫瘤藥物的作用；可在激活后分泌細胞外基質蛋白（如膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白）到腫瘤微環境中；具有促結締組織增生作用。研究［30－31］表明，在癌變過程中，CAF可產生炎性介質如CXCL8和IL－6，介導炎癥、腫瘤生長和血管生成，而KRAS/CXCR2信號通路在調節PDAC的CAF中起主要作用。

突變型KRAS對腫瘤細胞周圍基質也有影響。在PDAC中，豪豬（Hedgehog）信號通路被高度激活。SHh是豪豬信號通路的配體，通過NF－κB通路和KRAS可增加SHh的分泌，從而上調多種細胞外基質成分，如膠原蛋白、基質金屬蛋白酶、原纖維蛋白－1；SHh還能通過上調胰島素樣生長因子和生長停滯特異性基因6的表達來影響PSC細胞間信號傳導。PSC與腫瘤細胞間的通訊可促進局部腫瘤生長和癌癥的遠處轉移，當PDAC進展時，SHh在細胞通訊中的作用使得胰島素樣生長因子和生長停滯特異性基因6表達不斷升高，最終導致腫瘤細胞增殖活躍，同時增強抵抗凋亡的作用［32］。

攜帶KRAS突變的PDAC細胞可分泌趨化因子如GMCSF、IL－6。這些趨化因子激活多種免疫細胞，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、髓源性抑制細胞和巨噬細胞，導致腫瘤微環境的炎性狀態［10］。致癌突變型KRAS刺激血管生成因子（如VEGF）的釋放，激活YAP－TAZ途徑及其下游Janus激酶信號轉導和JAK－STAT3信號轉導，影響腫瘤微環境免疫抑制的情況、遠處轉移的可能性和對抗腫瘤藥物治療的反應。

炎癥、耐藥、纖維化、血管生成等微環境改變促使PDAC發生變異并選擇變異優勢克隆。KRAS作為PDAC細胞突變的主要類型，該信號通路的激活增強了細胞通訊能力、提高了趨化因子和血管生成因子的分泌水平，增強了PDAC細胞適應炎性環境、免疫抑制、遠處轉移和耐藥能力。

4 KRAS靶向治療現狀及展望

作為胰腺癌發生的中心，KRAS是一個關鍵的治療靶點。針對KRAS的治療策略共有3個方向：（1）直接靶向KRAS蛋白；（2）通過蛋白定位間接靶向KRAS；（3）通過干擾下游效應蛋白和信號通路影響KRAS致癌活性。但目前針對以上3方向尚無有效的藥物。

KRAS的點突變包括多種情況，其中在藥物治療態勢最好的是G12C突變型。AMG510、MRTX849、ARS－3248/JNJ－74699157和LY3499446均為靶向拮抗攜帶KRASG12C突變的PDAC細胞的藥物［33］。其中AMG510和MRTX849被確認可以在攜帶KRASG12C突變的PDAC患者中顯著縮小腫瘤大小［34－36］。此外，在攜帶KRASG12C突變的小鼠模型中觀察到使用AMG510后出現了以CD8＋為主的T淋巴細胞在腫瘤內的浸潤增殖，表明AMG510對腫瘤免疫微環境的改善［34］。然而在所有PDAC的病例中，KRASG12C突變僅占不到3%的比例，而將近50%的病例是攜帶KRASG12D突變。目前，CD8＋T淋巴細胞的過繼性移植在治療攜帶KRASG12D突變的結直腸腺癌患者中療效較好，而對于大部分攜帶KRASG12D突變的PDAC患者，這一治療手段仍待臨床試驗評估。

通過改變蛋白定位間接靶向KRAS基因的治療方法包括異戊二烯化抑制劑、Icmt抑制劑、PDE6δ抑制劑。法尼基轉移酶（FTase）介導KRAS細胞膜錨定域末端CAAX序列中半胱氨酸異戊二烯化（即法尼基化），在其中添加疏水鏈有利于膜穩定。法尼基轉移酶抑制劑可以靶向這一修飾作用，抑制KRAS與細胞膜的穩定結合。競爭性FTase抑制劑Tipifarnib已進入胰腺癌治療的三期臨床試驗，但由于GGTase介導的代替性異戊二烯化作用的存在，治療并未起效，FTase抑制劑與GGTase抑制劑的聯合使用也因為高毒性而禁用于臨床治療［37］。PDE6δ抑制劑Deltarasin是較有前景的藥物，PDE6δ參與KRAS膜定位的過程，抑制劑Deltarasin可阻斷KRAS突變型胰腺癌細胞上的膜定位作用，降低細胞增殖、促進細胞凋亡。

針對KRAS下游信號通路的靶向治療中，RAF－MEKERK MAPK通路是KRAS下游最具特征性的通路之一，作為KRAS突變型腫瘤的治療靶點，針對這條通路的研究廣泛且深入［38］。活化的KRAS通過誘導RAF的磷酸化和二聚化激活RAF，繼而啟動下游環環相扣的磷酸化過程，最終ERK激活促進細胞增殖的轉錄因子［39］。KRAS下游的MAPK通路激活對其致癌信號至關重要。目前開發的RAF、MEK和ERK抑制劑中，RAF抑制劑vemurafenib和dabrafenib對KRAS突變型惡性腫瘤治療失敗。

由KRAS信號激活的PI3K－AKT－mTOR通路也是藥物開發關注的中心通路，針對PI3K通路的抑制劑用作單一藥物治療PDAC療效不佳，推測原因是KRAS下游的信號通路存在交互，即使抑制了單一通路的某一環節也可“變道”至其他通路激活。因此，同時靶向PI3K和MAPK通路的聯合治療成為目前的潛在策略。

5 總結

PDAC的發病率呈逐年上升趨勢，其5年生存率極低，病死率與發病率幾乎接近。這歸咎于其高侵襲性及轉移性，而高KRAS突變率被認為是PDAC起始及進展的主要驅動因素。顯而易見，KRAS突變除刺激癌細胞分化、增殖、黏附、遷移，直接導致高侵襲性和轉移性外，還控制糖、脂、氨基酸及能量代謝重編程，使其適應缺氧、炎癥、免疫抑制及纖維化等微環境改變，逃逸免疫攻擊。KRAS信號通路無疑成為PDAC治療的主要靶標，但眾多臨床試驗結果并不滿意。新KRASG12C抑制劑只能使一小部分PDAC患者獲益，而對于PDAC的主要突變型KRASG12D目前并沒有批準的藥物。分子靶向治療結合免疫治療給PDAC患者帶來新希望，臨床試驗也正在積極研究多種KRAS相關途徑和分子，尋找可能的治療靶點。目前正在開展聯合療法的臨床試驗有：檢查點抑制劑Pembrolizumab聯合KRASG12C抑制劑Sotorasib（NCT04185883）、Pembrolizumab聯合Adagrasib（NCT04613596）、Sintilimab聯合LY3537982（NCT04956640）、

Atezolizumab聯合GDC－6036（NCT04449874）、Spartalizumab聯合JDQ443（NCT04699188）［40］。此外，考慮到PDAC特殊而復雜的腫瘤微環境，將KRAS靶向藥物與胰腺腫瘤微環境調節劑相結合，提高藥物遞送效率從而增強療效，這一思路也有待臨床試驗驗證其療效及安全性。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：陳懿對本文的思路和撰寫有關鍵貢獻；謝黎參與起草或修改文章關鍵內容；吳健負責文字的修改與定稿。