自身免疫性肝炎中隱匿性HBV感染的情況及其對疾病進展的影響

陳欣欣，張海萍，黃春洋，蘇建榮，閆惠平

1首都醫科大學附屬北京友誼醫院臨床檢驗中心，北京 100050；2首都醫科大學附屬北京佑安醫院臨床檢驗中心，北京 100069

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種由自身免疫反應介導的慢性肝臟實質細胞的炎癥，需要排除病毒性肝炎、酒精性或非酒精性脂肪性肝病等其他病因肝病后做出診斷，免疫抑制劑治療有效［1－2］。AIH的致病機制尚不完全清楚，與遺傳易感性、免疫紊亂、病毒感染（HBV、HCV）及環境等多種因素有關。

HBV感染是我國最主要肝臟疾病，經過數十年的乙型肝炎疫苗接種和有效的抗病毒治療，目前感染率已經明顯下降。隱匿性HBV感染（occult HBV infection，OBI）作為HBV的一種特殊感染形式，表現為HBsAg陰性，而血清和/或肝組織中檢測到HBV DNA［3］。因此，OBI仍具有傳播性，若使用免疫抑制治療的患者可出現HBV再激活，且與肝臟疾病的進展有關。除一般人群存在隱匿性HBV感染外，Georgiadou等［4］曾報道在AIH中OBI檢出率為13.64%（9/66）。國內關于AIH患者中OBI的情況鮮有報道。本團隊已對合并OBI的AIH患者HBV基因亞型及S基因的變異特點進行了報道分析［5］，本文旨在進一步研究OBI對AIH的疾病進展或預后有無影響，以期為疾病的診治提供一定的參考依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2012年4月1日—2019年3月31日期間北京佑安醫院診斷為AIH的患者樣本103例，其中17例患者已接受免疫抑制劑治療。全部患者HBsAg陰性，排除合并乙型肝炎、丙型肝炎、藥物性肝損傷等其他肝病者。AIH診斷標準參照國際AIH組織制定的AIH評分系統和簡化評分標準［6－7］，以及《自身免疫性肝炎診斷和治療共識（2015）》［8］。隨訪時間定義為從確診至最后1次統計或者患者死亡。87例（84.47%，87/103）患者成功進行隨訪，平均隨訪時間為26.53個月（范圍：1～74個月）。患者的預后主要考慮患者死亡和出現不良事件，不良事件包括出現肝硬化、肝硬化失代償、肝移植。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗室常規指標檢測 羅氏combas e601型全自動電化學發光免疫分析系統檢測HBV標志物；Olympus AU5400全自動生化分析儀檢測生化指標，如ALT、AST等；羅氏（Roche）E170檢測免疫學指標，IgG、IgA、IgM、C3、C4等；間接免疫熒光法和免疫印跡法檢測自身抗體，如抗核抗體（ANA）、抗平滑肌抗體（SMA）、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體（SLA/LP）等，試劑購自德國歐蒙公司。

1.2.2 HBV DNA提取和檢測 103例患者的血清標本均為首診時采集保存，利用QIAamp mini Elute病毒核酸提取試劑盒提取待測樣本血清中的核酸。由于隱匿感染者體內HBV DNA含量很低，一般檢測方法可能會漏檢。依據2008年歐洲肝病學會（EASL）國際OBI感染研討會推薦的巢式PCR的方法［3］，對HBV基因組的C、P、X、S四個開放閱讀框的區域進行巢式PCR擴增，并進行Sanger測序分析。將乙型肝炎陽性標本DNA作為陽性對照，健康人血清DNA為陰性對照，Nuclease－Free Water為空白對照，每個樣本均進行2次重復實驗。當HBV兩個或兩個區域以上擴增陽性時判為HBV DNA陽性。本研究相關引物合成和測序均由北京睿博興科生物技術有限公司完成。

利用COBAS?AmpliPrep/COBAS?TaqMan?病毒載量全自動系統，檢測OBI患者血清中HBV DNA病毒載量。

1.2.3 OBI患者血清HBV pgRNA的檢測 血清HBV pgRNA的檢測采用HBV pgRNA測定試劑盒（PCR－熒光探針法），定量測定血清標本中的HBV pgRNA。試劑盒購自北京熱景生物技術股份有限公司。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。符合正態分布計量資料用s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布計量資料用中位數（最小值～最大值）表示，兩組間比較采用Mann－Whitney U秩和檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗和Fisher檢驗。Kaplan－Meier法繪制生存曲線，采用Cox回歸模型進行單因素和多因素分析，并計算風險比（HR）及95%CI。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AIH患者中OBI的確定 103例AIH患者經巢式PCR擴增并測序，結果顯示，24例（23.30%，24/103）標本在兩個或者兩個以上HBV DNA閱讀框區域的巢式PCR擴增陽性（圖1），參照指南中OBI的診斷標準［3］，診斷為OBI。

圖1 C、S、P、X四個閱讀框的巢式PCR擴增電泳圖Figure 1 The results of nesting PCR amplification of C，S，P，X four reading frames

為避免假陽性“False”OBI的存在［9］，對HBV DNA病毒載量同時進行定量分析。14例（58.33%，14/24）HBV DNA病毒載量低于20 IU/mL，10例（41.67%，10/24）HBV DNA病毒載量＞20 IU/mL，最高值為1.43×102IU/mL，均＜200 IU/mL。再次證實這24例符合OBI診斷，而且患者HBV DNA均處于低拷貝復制狀態，無“False”OBI。

2.2 HBV基因分型結果 對24例OBI血清HBV S基因成功進行了巢式PCR擴增和測序，測序結果進行HBV基因分型分析。其中19例OBI標本成功進行直接測序，11例（57.89%，11/19）為HBV C基因型，8例（42.11%，8/19）為HBV B基因型，未見其他基因型。5例直接測序失敗的標本進行克隆測序，結果顯示：其中4例為混合基因型感染（HBV B＆C），且混合感染樣本中基因型C所克隆樣本數目高于基因型B（72.50%vs 27.50%）（詳細結果見［5］）。

2.3 合并OBI的患者血清HBV pgRNA水平 通過PCR熒光探針法檢測AIH合并OBI感染的24例患者的血清中HBV pgRNA，以評估其cccDNA的轉錄活性和HBV的感染力。結果顯示：15例（62.50%，15/24）患者的血清HBV pgRNA＜300拷貝/mL。9例（37.50%，9/24）患者的血清HBV pgRNA＞300拷貝/mL，在這9例OBI患者中，其肝細胞核中具有較高的cccDNA的轉錄活性（圖2）。此9例標本HBV基因分型結果顯示，3例為B型，4例為C基因型，2例為B/C混合感染基因型。

圖2 AIH合并OBI患者血清的HBV pgRNA水平Figure 2 HBV pgRNA in serum of patients with AIH combined with OBI infection

2.4 OBI患者主要臨床和實驗室指標的比對分析 103例AIH患者分為兩組：合并OBI組（n＝24）、無OBI組（n＝79）。與無OBI組相比，合并OBI組患者在年齡和性別分布上、生化指標（如ALT、AST等）和免疫學等指標（如ANA、SMA等）均未見明顯統計學差異（P值均＞0.05）（表1）。

表1 AIH患者（是/否）合并OBI的生化免疫指標比較Table 1 Biochemical and immunological characteristics of OBI patients

HBV血清標志物：103例AIH患者均為HBsAg陰性，其中，44例（42.72%）為抗－HBc陽性，與無OBI組比，抗－HBc對OBI的檢出無統計學意義（P＞0.05），但HBV的三個抗體（抗－HBc/抗－HBs/抗－HBe）同時陽性在合并OBI組出現的比例顯著高于無OBI組（χ2＝5.906，P＝0.016）（表2）。

表2 AIH患者是/否合并OBI的HBV血清標志物比較Table 2 The comparison of HBV serum markers in AIH patients with or without occult HBV infection

2.5 隨訪和預后 87例（84.47%，87/103）患者成功進行隨訪，其中21例為合并OBI的患者。隨訪時間平均值為26.53（1～74）個月。隨訪過程中共14例（16.09%，14/87）患者出現不良事件，5年的生存率為67.82%。21例OBI組患者組中，6例（25%，6/24）出現了不良事件，其5年的生存率為61.90%（圖3）。單因素的生存分析發現：OBI、低蛋白血癥、脾腫大、腹水為AIH不良事件的危險因素（P值均＜0.05），與疾病進展相關。進一步行多因素Cox回歸分析發現，低蛋白血癥、腹水為不良事件相關的獨立危險因素（P值均＜0.05）（表3）。

表3 AIH患者產生不良事件的單因素和多因素分析Table 3 Univariate and multivariate analysis of adverse events in patients with AIH

圖3 AIH患者生存曲線的比較Figure 3 Predicting clinical outcomes of AIH patients stratified by OBI

3 討論

OBI的危害在于［10－14］：（1）由于患者HBsAg陰性但HBV DNA陽性，其具有的傳染性易被忽略；（2）HBV存在被再激活的可能性，已有報道證明在某些特定情況下（如患者接受免疫抑制劑治療、接受放化療等），隱匿的HBV可被再激活，患者出現肝功能異常、肝細胞損傷、病毒復制活躍，有可能加速疾病的進展。（3）OBI可能是加速肝病進展，形成肝硬化或向HCC發展的重要危險因素之一。有文獻［15］報道，在類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡等風濕免疫疾病患者長期接受免疫抑制劑治療過程中患者出現ALT升高，HBV DNA陽性，表現出OBI的再激活。因此，建議對可能發生HBV再激活的患者，激素治療前先期應用抗HBV治療。AIH是一種免疫介導的肝實質細胞炎癥，免疫抑制劑治療有效。那么，AIH患者中是否也存在伴OBI，感染率如何，對疾病的進展有無影響？這些問題國內罕見報道。

本研究表明AIH患者中存在較高的OBI感染率（23.30%），高于與希臘患者相關的報道（13.64%）［4］，此結果可能與HBV流行的地域性差異有關。OBI在AIH患者中的檢出率也高于我國普通人群曾報道的OBI的檢出率（2.0%～11.5%）［9］。此前筆者團隊報道［5］了合并OBI的AIH患者HBV病毒學特點：HBV基因型為B型和C型，存在B/C混合型；AIH患者合并的OBI與顯性的HBV感染者病毒基因型分布特點一致；還報道了多個與OBI發生及疾病進展相關的氨基酸突變位點，有助于更好地了解AIH患者合并OBI的病毒學特點。

HBV感染肝細胞后在細胞核形成共價閉合環狀DNA（cccDNA）并持續存在，是乙型肝炎患者難以停藥及停藥后發生病毒學反彈的主要因素［16－17］。HBV前基因組RNA（Pregenomic RNA，pgRNA）是cccDNA的轉錄產物，以病毒顆粒形式表達于HBV相關肝病患者的血清中，是反映肝細胞內cccDNA轉錄活性的理想指標［18］。為了解OBI感染后病毒是否也在肝細胞核內形成cccDNA，本研究對24例OBI患者血清進行HBV pgRNA的檢測，其中9例（37.50%，9/24）HBV pgRNA＞300拷貝/mL。結果表明，發生OBI的AIH患者的肝細胞核中也存在較高的cccDNA的轉錄活性。隨訪中對87例中的11例合并OBI的AIH患者進行近2年的HBV DNA病毒載量的檢測沒有顯著的變化，尚未發現HBV再激活情況。但是，建議臨床在免疫抑制劑治療AIH的過程中應注重對這類患者HBV DNA的實時監測，以防止HBV的再激活，影響治療甚至疾病的進程。

單項抗－HBc陽性通常被認為是HBV既往感染的標志物，不過在抗－HBc陽性的HCV感染者中可能有更高的OBI患病率［19］，但也有文獻［20］得出了相反的結論。本研究顯示，AIH患者抗－HBc陽性率為42.72%（44/103），顯著高于正常人群抗－HBc陽性率（7.2%～11.7%）的報道［9，21］。且AIH合并OBI的患者與三種HBV血清標志物（抗－HBs＆抗－HBc＆抗－HBe）同時陽性具有顯著相關性（P＝0.016），而與抗－HBc單獨陽性者相關性不顯著。此外，24例OBI患者的樣本中9例（37.50%，9/24）為HBV血清學標志物全部陰性，此現象也在丙型肝炎患者合并OBI的病例中有過報道［22］。因此，無論是在HBV血清學標志物陽性或者陰性的AIH患者中，均有可能存在合并OBI的可能，這也為AIH患者的OBI診斷提出了一定的挑戰。

本研究對患者的部分臨床信息和實驗室結果做了分析，與非OBI組相比，OBI組患者在年齡和性別分布上、生化指標（如ALT、AST等）和免疫學等指標（如ANA、SMA等）未發現明顯統計學差異，推測可能與病例數較少以及AIH患者的高度個體化免疫抑制劑治療有關。

在對HCV和HIV的研究中有文獻［23－24］報道，合并OBI可能增加慢性HCV感染者發生HCC或肝硬化的風險。合并OBI對AIH疾病進程有無影響？在國內外還鮮有報道。本文對87例AIH患者進行了隨訪，其中21例為合并OBI的AIH患者，研究發現合并OBI與低蛋白血癥、脾腫大、腹水均為AIH不良事件的危險因素，影響疾病預后。與非OBI組相比，合并OBI的AIH患者不良事件的累計發生率高于單純AIH患者組（P＝0.027），提示合并OBI可能加速AIH疾病的進展，臨床醫生應關注AIH合并OBI的及時診斷并制訂更適合的治療方案，臨床不應忽略AIH合并OBI的問題。

總之，本研究證實了AIH患者中存在OBI，且感染率較高。但血清HBV DNA處于低或極低水平，部分患者HBV pgRNA陽性，表明存在病毒隱匿傳播和病毒再激活的風險。合并OBI可能是影響AIH患者預后的危險因素之一。這些結果對深入認識AIH合并OBI的問題提供了可靠的數據信息。

倫理學聲明：本研究方案于2012年5月22日和2021年12月30日經由首都醫科大學附屬北京佑安醫院倫理委員會審批，批號為［2012］44號和［2021］392號。患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：閆惠平、蘇建榮對研究的思路、設計、論文的審閱等有關鍵貢獻；陳欣欣參與了研究實驗的設計，實驗的實施、數據的獲取分析解釋過程，參與起草或修改文章關鍵內容；張海萍、黃春洋參與了實驗和數據分析。