半滑舌鰨腸道中抗氧化活性乳酸桿菌的篩選與鑒定

郭 東， 包瑞璇， 王 逸， 盧 靜， 呂明生*， 王淑軍

（1.江蘇海洋大學海洋生物資源與環境重點實驗室/海洋生物技術重點實驗室，江蘇海洋大學，江蘇連云港 225005；2.江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，江蘇連云港 222000）

半滑舌鰨魚（Cynoglossus semilaevis）屬于舌鰨屬，經中國水產研究院黃海研究所成功訓化后，是我國重要水產養殖品種之一（張馨馨，2021）。魚體內脂肪中含有豐富的不飽和脂肪酸，具有防止動脈粥樣硬化、防治心血管疾病、增強記憶力和防止視力衰退等功效（張永真等，2016；王娜，2010）。該種魚多產于我國渤海灣、膠州灣和海州灣等海域（孫中之等，2005），近年來隨著養殖數量的增加，腹水病、爛鰭病、腸炎病等疾病經常發生（蘇兆軍，2015）。水產養殖中急需有效的病害防控措施。

乳酸菌是水產養殖中重要的微生態菌種之一，通過產生有機酸、乳酸菌素等提高養殖動物抵抗力（鞏華等，2018）。研究發現，乳酸菌和發酵產物還具有抗氧化作用。通過在飼料中添加具有抗菌和抗氧化作用的乳酸菌，可以實現健康養殖（曹衛華，2017）。本研究從半滑舌鰨魚腸道中篩選乳酸菌，并對其生長特性、抑菌作用、抗氧化活性以及其對飼料脂質抗氧化作用進行了研究，擬為獲得的乳酸菌的應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原材料 健康的半滑舌鰨魚：水產品養殖場；高脂半滑舌鰨魚飼料：通威股份；創傷弧菌、大腸桿菌、副溶血弧菌、維氏氣單胞菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、庫氏鏈霉菌、擬桿菌、嗜水氣單胞菌等指示菌株：江蘇海洋大學海洋資源與環境重點實驗室。

1.1.2 試劑與培養基 胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K：購于南京都萊生物技術有限公司；過氧化氫酶：購于上海阿拉丁試劑；革蘭氏染色試劑盒：購于北京索萊寶科技有限公司；DNA marker2000、DNA marker5000：購自Takara-寶日醫生物技術（北京）有限公司；電泳用瓊脂糖：購于BIOWEST公司；細菌DNA基因組提取試劑盒：購于生工生物工程（上海）股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：Sigma公司；MRS肉湯：北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.3 儀器設備 1510酶標儀：美國Thermo公司；SPX-150B-Z生化培養箱：上海博訊實業有限公司；XN-26高速冷凍離心機：美國Beckman Coulter公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌鑒定

1.2.1.1 革蘭氏染色 將培養10 h的菌株進行革蘭氏染色鑒定。

1.2.1.2 16SrDNA鑒定 將革蘭氏染色陽性的菌株提取基因組，選用細菌鑒定通用引物，經提取菌株基因組，PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測后寄上海生工生物公司檢測，測序結果與GenBank數據庫比對后繪制系統進化樹（高鵬，2016；呂愛軍等，2010）。

1.2.2 乳酸菌對病原菌的抑制 采用牛津杯法。將分離菌株接種MRS液體培養基，37℃，48 h，取部分發酵液7300×g，4℃離心30 min（郭鳳茹，2019；Komora等，2017）。選取創傷弧菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、哈維氏菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、庫氏鏈霉菌、擬桿菌和嗜水氣單胞菌活化后，稀釋涂布于LB培養基，滅菌牛津杯放置涂菌培養基表面加入200μL發酵上清液，37℃，24 h，測定抑菌圈直徑。

1.2.3 乳酸菌生長特性

1.2.3.1 耐酸性 將菌株接種于用1 mol NaOH和1 mol的HCl調節pH至2.0和3.0的MRS液體培養基中，37℃培養，分別于0、2、4、6 h取樣測定發酵液OD600（杜金城等，2016；Pakarian等，2016），不調節pH的MRS培養基為對照。

1.2.3.2 耐膽鹽 在MRS液體培養基添加0、0.1%、0.3%、0.5%的膽鹽（杜金城等，2016；郝志明等，2006）。接種菌株，37℃培養，分別于0、2、4、6 h取樣測定發酵液OD600。

1.2.4 抗生素對乳酸菌生長的影響 采用藥敏紙片擴散法。菌株100μL菌液涂布MRS培養基，放置數分鐘，選用硫酸卡那霉素、氨芐青霉素、硫酸鏈霉素和氯霉素四種抗生素，藥敏試紙含抗生素量為10μg/mL。將藥敏試紙分別放置于培養基，37℃培養24 h（任士菊等，2014；Newaj-Fyzul等，2014），測定抑菌圈直徑。

1.2.5 抑菌物質的鑒定 分別檢測過氧化氫酶、蛋白酶、pH、加熱處理和超濾對抑菌物質活性的影響，采用牛津杯法，測定上清液抑菌圈的大小（馬迎濤，2016；Ngo，2015）。

1.2.5.1 過氧化氫酶 調節菌株發酵上清液至過氧化氫酶的最適pH 7.0，加入濃度為5 mg/mL的過氧化氫酶，37℃處理2 h，處理后調節pH與對照上清液相同。

1.2.5.2 蛋白酶 菌株發酵上清液分別加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶，使其終濃度為5 mg/mL，分別在酶的最適溫度和pH條件下2 h，將上清液pH調至與對照組相同（Papagianni，2015）。

1.2.5.3 pH 菌株發酵上清液的pH調節至3.0、5.0、7.0、9.0，對照為未調節pH。

1.2.5.4 加熱處理 菌株發酵上清液置于60、80、100℃條件下處理15 min，未處理的上清液為對照（遲海等，2020）。

1.2.5.5 超濾 檢測活性物質的分子量。選用3、10、30、50 K和100 K超濾管，取5 mL發酵上清液超濾，4℃，2400×g離心后，取200μL，采用牛津杯法檢測。指示菌為副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌。

1.2.6 乳酸菌發酵液的抗氧化活性 菌株發酵上清液、菌懸液及無細胞提取物（CFE）的制備（Li等，2013；Chen等2008）。菌株以1%接種MRS液體培養基，于37℃培養16 h。（1）發酵液4℃條件下，7300×g離心30 min，收集上清液和菌體；（2）菌體經PBS緩沖液洗3次，調整濃度為1.0×1010cfu/mL菌懸液；（3）取部分菌體超聲（1500 W，10 min）破碎，4℃，7300×g離心30 min，上清液為CFE。

1.2.6.1 超氧陰離子自由基的清除能力 在含有0.05 mol的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，4.5 mL）和2.5mol的鄰苯三酚0.4 mL溶液中加入樣品100μL，置于25℃恒溫水浴中放置8 min，立即滴加一滴8 mol HCl終 止反應 （余芳等，2017；Box等，2014）。在325 nm波長測定吸光度。樣品的吸光度：A1，生理鹽水代替樣品：空白對照A0。

超氧陰離子自由基清除率/%=（A0-A1）/A0×100。

1.2.6.2 羥自由基（·OH）的清除能力 在試管中加入的FeSO4溶液（5 mol）2 mL，C7H6O3-C2H5OH（5 mol）2 mL，H2O2溶液（3 mol）2 mL，混合均勻，加入3 mL樣品，37℃保溫20 min，在4℃，7300×g離心10 min，上清液測定OD510數值為Aβ。以無菌生理鹽水代替H2O2為空白，測定的吸光度數值為Aα；生理鹽水代替樣品為對照，測定的吸光度數值為Aε（Das等，2015）。

·OH自由基的清除率/%=[1-（Aβ－Aα）]/Aε×100。

1.2.6.3 DPPH自由基的清除能力 試管中加入樣品和含有0.2 mol DPPH的無水乙醇溶液各2 mL，混均后避光靜置30 min，4℃，7300×g離心10 min，取上清液測定OD517數值為Aγ。空白不含DPPH，記為Aθ，對照為無菌水，記為AΩ（黃玉軍，2013）。

DPPH自 由 基 清 除 率/%=[1-（Aγ－Aθ）]/AΩ×100。

1.2.6.4 還原能力 玻璃試管加入樣品、K3[Fe（CN）6]（1%）、pH 6.6的PBS緩沖液各1 mL，混合均勻后（姚杰玢等，2015），50℃保溫15 min，降至室溫后加入1 mL的10%體積的C2HCl3O2，混勻，于4℃，7300×g離心10 min。取上清液、純水和三氯乙酸試劑（0.1%）各2 mL，充分混勻，靜置5min后 測 定OD700（Mikulski等，2020；Wang，2020）。樣品的吸光度值為Aa，以PBS緩沖液代替樣品的吸光度值為Ab。

還原能力/%=（Aa-Ab）/Ab×100。

1.2.7 抗脂質過氧化 取250 g高脂質半滑舌鰨魚飼料樣品碾碎成粉末，加入50 mL培養16 h的菌懸液或發酵上清液，拌勻，空白對照不加。于60℃條件下放置24 h后取出放入500 mL錐形瓶中，加入適量石油醚浸沒樣品，靜置24 h后過濾，置于45℃烘箱內干燥2 h，參考伍立鋒等（2011）的方法測OD572并繪制標準曲線計算過氧化值。

1.3 數據分析 采用三組平行試驗設計，利用Origin 2021進行作圖，應用IBM SPSS Statistics 26進行數據處理與統計，MEGA 7.0繪制系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌鑒定

2.1.1 革蘭氏染色結果 經過多輪篩選，共獲得有透明圈的菌株32株。經革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色觀察。其中，菌株CS1、CS2、CS4為革蘭氏陽性，桿菌、無芽孢、無鞭毛、菌端鈍圓。結果見圖1。

圖1 菌株CS1、CS2、CS4革蘭氏染色結果

2.1.2 菌株16SrDNA的序列分析 三株菌16S rDNA的PCR產物的瓊脂糖電泳見圖2，產物大小約為1500 bp。經上海生工進行測序、比對，構建的系統進化樹見圖3、圖4、圖5。

圖2 16S rDNA PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果

圖3 菌株CS1系統進化樹

圖4 菌株CS2系統進化樹

圖5 菌株CS4系統進化樹

菌株CS1和CS2與發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）的同源性為99%；CS4與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的同源性為98%，確定三菌株分另為Lactobacillus sp.CS1，Lactobacillus sp.CS2，Lactobacillus sp.CS4。

2.2 菌株對病原菌生長的影響 菌株發酵上清對病原菌生長的影響見表1。菌株CS1對大腸桿菌、維氏氣單胞菌、副溶血弧菌、枯草芽孢桿菌抑菌能力最強，對庫氏鏈霉菌、擬桿菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌抑制能力次之，對霍亂弧菌以及創傷弧菌則無明顯的抑制作用。菌株CS2和CS4對維氏氣單胞菌的抑菌能力最強，對創傷弧菌、霍亂弧菌以及幽門螺旋桿菌則無抑制作用，對其余菌株均有不同程度的抑制作用。結果表明，菌株的上清液可抑制病原菌生長，具有廣譜抑菌效果。

表1 菌株上清液的抑菌圈直徑結果

2.3 菌株的生長特性

2.3.1 耐酸性研究結果 菌株CS1、CS2、CS4在pH 2～3條件下均可生長，生長速率略有降低（圖6）。該特性有利于菌株在腸道中的定植。

圖6 菌株CS1、CS2、CS4在不同pH條件下的生長曲線

2.3.2 耐膽鹽研究結果 從圖7可以看出，在0.1%膽鹽濃度條件下，菌株CS1、CS2、CS4均可正常生長。隨著膽鹽濃度的增加，對菌株CS1、CS2、CS4的生長有一定影響。在0.5%膽鹽條件下，菌株的生長速率較正常條件降低40%左右。腸道中膽鹽可以抑制微生物的生長，菌株在不同膽鹽條件下的生長特性有利于其成為腸道優勢菌。

圖7 菌株CS1、CS2、CS4在不同濃度膽鹽下的生長曲線

2.4 藥敏試驗 由表2可知，氨芐青霉素鈉、氯霉素對乳酸菌的生長有顯著的抑制性，顯示出清晰的抑菌圈，而菌株CS1、CS2、CS4對硫酸鏈霉素和硫酸鹽卡那霉素則不敏感。

表2 乳酸菌對抗生素的耐藥性

2.5 抑菌物質活性研究

2.5.1 排除過氧化氫試驗結果 由表3可以看出，經過氧化氫酶處理后的上清液，菌株CS1、CS2、CS4的抑菌圈略有下降，但差異不顯著。結果表明，乳酸菌不是通過產生H2O2抗菌的。

表3 乳酸菌上清液排除過氧化氫試驗結果

2.5.2 蛋白酶對抑菌物質活性影響的試驗結果由表4可知，經蛋白酶K處理后，沒有抑菌活性，經胰蛋白酶處理后，抑菌活性顯著降低。木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對上清液的抑菌作用沒有影響。推測上清液中抑菌成分為蛋白質，這與王騰騰（2017）從許氏平鲉腸道中分離的乳酸菌的結果相似。

表4 乳酸菌上清液驗證蛋白性試驗結果

2.5.3 pH對抑菌物質活性的影響 由表5可見，在酸性條件下，菌株CS1、CS2、CS4的發酵上清液對指示菌株的抑制能力沒有顯著差異；在中性條件下，抑菌能力下降；堿性條件時，抑菌能力喪失。

表5 pH對乳酸菌上清液抑菌的影響

2.5.4 抑菌物質熱穩定性研究試驗結果 菌株CS1、CS2、CS4發酵上清液經不同溫度處理后，其抑菌能力均未有顯著變化（表6），表明抑菌物質具有較強的耐高溫能力，短時間在高溫條件下處理，其抑菌能力不受影響。

表6 乳酸菌上清液熱穩定性影響的試驗結果

2.6 抑菌物質的抗氧化活性

2.6.1 對超氧陰離子自由基（O2-）的清除能力 由圖8可見，三株試驗菌株的上清液對超氧陰離子的清除能力最強，其中，菌株CS1最強達到（29.8±2.41）%，高于菌株CS2與CS4。三株菌株的無細胞提取物的清除能力弱，表明抗氧化物主要為菌株發酵的胞外產物。與劉洋等（2012）的研究結果相同。

圖8 對超氧陰離子的清除結果

2.6.2 對羥自由基（·OH）的清除能力 由圖9可知，菌株CS1、CS2、CS4的發酵上清液對羥基自由基的清除能力最強，菌懸液次之，無細胞提取物對羥基自由基的清除能力最弱；不同菌株間，CS2的上清液較其他菌株清除能力較強，達 （35.0±1.54）%；對羥基自由的的清除能力強弱則體現了該物質抗氧化能力的大小。

圖9 對羥基自由基的清除結果

2.6.3 對DPPH自由基的清除能力 菌株的發酵上清液對DPPH清除能力最強，其中，菌株CS1達到（52.6±4.10）%，最弱的是菌株CS2，清除能力為（41.7±1.55）%。菌懸液的DPPH清除能力次之，無細胞提取物清除能力最弱。

圖10 對DPPH自由基的清除結果

2.6.4 菌株發酵液的還原能力 從圖11可以看出，菌株發酵上清液的還原能力最強，其中，菌株CS2為（27.5±3.12）%，明顯高于其他兩株菌株。從菌懸液的角度，菌株CS4的還原能力最強，為（20.3±2.35）%，甚至高于其自身上清液。

圖11 菌株發酵液還原性試驗結果

2.7 活性物質分子量估算 選取嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌作為指示菌，利用超濾管能將不同分子量物質分離開來的特性，表7和表8顯示，菌株CS1、CS2、CS4的上清液中的抑菌物質主要存在于3～10 kDa，且對于不同病原菌，抑菌物質存在一定差異。結果表明，不同乳酸菌的產物和作用機制有較大的差異，與王偉（2018）試驗結果相同。

表7 不同分子量范圍的上清液對嗜水氣單胞菌的抑制能力

表8 不同分子量范圍的上清液對副溶血弧菌的抑制能力

2.8 抗脂質過氧化 由圖12可見，與空白相比，加入乳酸菌或其發酵上清的飼料，其抗脂質氧化作用顯著提高，單純加入發酵上清的效果最好。其中，菌株CS4的作用最強。

圖12 乳酸菌菌株的抗脂質過氧化作用

從半滑舌鰨腸道中篩選獲得的乳酸桿菌菌株CS1、CS2和CS4，具有一定的抵抗病害菌的能力，還可以提高飼料的抗脂質過氧化能力，在水產飼料加工中具有一定的應用潛力。

3 結論

從半滑舌鰨腸道中篩選并鑒定了三株乳酸桿菌菌株CS1、CS2和CS4，對病害菌具有一定的抑制能力，其中，對維氏氣單胞菌的作用最強。氨芐青霉素鈉和氯霉素對乳酸菌的生長有顯著的抑制性；相反，菌株對硫酸鏈霉素和硫酸鹽卡那霉素不敏感。通過排除試驗，推測抑菌物質為一種耐熱的蛋白質，分子量在3～10 kDa。菌株在低pH和膽鹽存在條件下可以生長。菌株發酵液具有抗氧化活性，其在飼料中添加可以顯著提高飼料的抗脂質過氧化能力。乳酸桿菌CS1、CS2和CS4在水產養殖以及水產飼料加工中具有一定的應用潛力。