中西醫結合治療對慢性阻塞性肺疾病痰熱證急性加重-穩定期大鼠免疫因子的影響研究

李曉俊 ，李亞 ，3，卞晴晴 ，軒銀霜 ，沈婷婷 ，李素云 ，3*

慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性加重期（AECOPD）是COPD管理中的重要事件，嚴重影響患者的健康狀況、疾病進展和住院/再入院率［1］。COPD患者氣道表面普遍存在分泌型免疫球蛋白A（sIgA）缺損［2］，與氣流阻塞的嚴重程度相關［3-4］。sIgA介導宿主保護和病原體中和［5］，位于免疫系統抵御病原體的第一道防線。人體胃腸道與呼吸道具有典型的黏膜結構，均能分泌大量sIgA，并通過歸巢遷移及共同免疫系統相聯系，成為肺與大腸相關性的重要基礎［6］。COPD患者肺間質及實質等組織活檢［7］發現大量T淋巴細胞聚集現象，表現為CD8+細胞數量增加，CD3+和CD4+細胞數量基本不變或稍降，CD4+/CD8+下降，導致免疫失衡［8］，是COPD發生和發展的關鍵因素［9-10］。中西醫結合治療COPD可以顯著改善患者癥狀、減少并發癥、改善肺通氣功能、降低致殘率等［11-12］，但中西醫結合治療COPD痰熱證急性加重-穩定期對肺組織和腸組織的sIgA、CD3+及CD4+的影響缺乏相關證據。本研究通過觀察中西醫結合治療對COPD痰熱證急性加重-穩定期大鼠的用力肺活量（FVC）、第0.3秒用力呼氣容積（FEV0.3）、FEV0.3/FVC以及肺、腸組織的sIgA、CD3+和CD4+水平產生的影響，明確中西醫結合治療對肺組織和腸組織的免疫屏障功能的修復作用，以期為COPD的中醫藥診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2019年9月至2020年12月選取SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質量（200±20）g，購于濟南朋悅實驗動物繁育中心〔許可證號：SCXK（魯）2019-0003〕。

1.2 香煙 紅旗渠牌過濾嘴香煙，硬金紅，烤煙型，焦油量10 mg，煙堿量1 mg，煙氣一氧化碳含量12 mg，河南中煙工業有限責任公司生產。

1.3 藥物 脂多糖（LPS，100 mg，Sigma，USA，使用前用0.9%氯化鈉溶液溶解為1 mg/ml）。0.9%氯化鈉溶液（500 ml/瓶，河南竹林眾生制藥股份有限公司）。通塞顆粒（TSG，藥物組成為葶藶子15 g、地龍15 g、赤芍12 g、川貝母10 g、生曬參10 g、麥冬15 g、炙麻黃9 g、制大黃6 g、石菖蒲10 g，由河南中醫藥大學藥學院中藥制劑實驗室鑒定提供，專利號：ZL201010183177.1）。補肺益腎方（BYG，藥物組成為黃芪15 g、黨參9 g、枸杞子12 g、浙貝母9 g、山茱萸12 g等，制成流浸膏備用，含生藥量1.848 g/ml，由河南中醫藥大學藥學院中藥制劑實驗室鑒定提供，專利號：ZL201110117578.1）。鹽酸莫西沙星片（MXF，0.4 g×3 s，拜復樂，拜爾醫藥保健有限公司，國藥準字J20150015）。硫酸沙丁胺醇片（STL，2 mg×100 s，金壇，江蘇亞邦愛普森藥業有限公司，國藥準字H32024535）。

1.4 試劑和儀器 大鼠酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒和大鼠sIgA（E-EL-R0875c）購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，石蠟塊、二甲苯溶液、無水乙醇和中性樹脂購于國藥集團，兔抗大鼠多克隆抗體CD3（E-AB-40132）購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，兔抗大鼠多克隆抗體CD4（K006374P）購于北京索萊寶科技有限公司，鏈霉親和素-堿性磷酸酶（SABC-AP）免疫組化染色試劑盒（SA1055）購于武漢博士德生物工程有限公司。WBP無束縛小動物全身體積描記儀和Fine PointeTM series PFT檢測系統購于美國諦思藹貿易有限公司，烘箱購于上海新苗醫療設備有限公司，BS210S電子天平購于德國賽多利斯集團，LDZ5-2離心機購于美國賽默飛世爾科技有限公司，RM2145自動切片機購于德國徠卡顯微系統貿易有限公司，YT-7F8生物組織攤烤片機和YB-6LF生物組織石蠟包埋機購于湖北省孝感市亞光醫用電子技術有限公司，PM-10AD光學顯微鏡及圖像采集系統購于日本奧林巴斯銷售服務有限公司，IVC-Ⅱ動物飼養籠具購于江蘇省蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司。

1.5 實驗方法 大鼠適應性飼養7 d，室溫（25±1）℃，濕度（50%±10%），換氣量（15±5）次/h，氨濃度≤14 mg/m3，噪聲≤60 db。12 h晝夜交替照明，自由飲純水、飼料。采用EXCEL RAND函數法將60只大鼠隨機分為對照組、COPD穩定期（COPD）組、AECOPD組、西藥組、中西醫結合組。每日觀察并記錄大鼠一般情況，包括皮毛色澤，活動度，靈敏度，進食、進水量等。本實驗已通過河南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會審批（批號：YFYDW2018015）。

1.6 模型制備

1.6.1 預實驗 采用梯度濃度LPS溶液鼻腔內滴注聯合香煙煙霧暴露法制備COPD穩定期-急性加重期模型，熱暴露法模擬痰熱證。80只大鼠隨機分為對照組、LPS 0.5 mg組、LPS 1.0 mg組、LPS 2.0 mg組，每組20只。第0周、第4周、第8周、第12周和模擬急性加重前，檢測肺功能并分析數據；第8周、第12周結束時，分批取材觀察肺組織病理。除對照組、COPD組外，第13周第1天起，半數模型大鼠進行熱暴露并持續9 d，模擬痰熱證。第13周第6天，將熱暴露的大鼠鼻腔內一次性滴注濃度加倍的LPS模擬急性加重期。第13周第5天起，每日檢測所有大鼠肛溫，隔日尾靜脈采血，檢測血常規各指標，血清C反應蛋白（CRP）和血清淀粉樣蛋白A（SAA）表達水平至炎性指標恢復至接近COPD穩定期水平。

綜合肺組織病理、肛溫、CRP和SAA，LPS 1.0 mg組大鼠于第8周末已成功建立COPD穩定期大鼠模型，LPS溶液濃度適宜，大鼠死亡率低。確定COPD穩定期大鼠模型的建立周期為8周，LPS鼻腔內滴注的最佳濃度為1 mg/kg體質量，COPD痰熱證急性加重期的LPS最佳濃度為2 mg/kg體質量，急性加重持續時間為6～8 d。該模型的炎癥特點、肺功能、肺形態學具有穩定性，適宜用于后續研究。

1.6.2 實驗模型 COPD穩定期模型：除對照組外，其余組別給予LPS溶液以1 mg/kg體質量經鼻腔滴入，2次/周，持續8周［13］；對照組大鼠滴入等體積0.9%氯化鈉溶液。除對照組外，其余組別均進行香煙煙霧暴露，采用有機玻璃熏煙箱，體積189 L，煙霧濃度（3 000±500）ppm，30 min/次，2次/d，間隔≥3 h，持續8周；對照組大鼠置于通風良好的室內。經鼻腔滴入LPS溶液當天，不進行香煙煙霧暴露。模型成功標準依據預實驗及文獻［14］。

COPD痰熱證急性加重期模型：除對照組、COPD組外，于造模第9周第1天起，將半數模型大鼠置于烘箱進行熱暴露，溫度（38±1）℃，濕度50%，風速1 m/s，30 min/次，2次/d，間隔≥3 h，持續9 d模擬痰熱證［14］。實驗第9周第6天給予熱暴露的大鼠鼻腔滴入LPS溶液2 mg/kg體質量模擬急性加重期。急性加重當天，不進行熱暴露。

1.7 藥物干預 西藥組、中西醫結合組于造模第9周第7天分別灌胃相應藥物，急性加重期灌胃持續8 d、穩定期灌胃持續14 d［14］，對照組、COPD組及AECOPD組全程灌胃0.9%氯化鈉溶液，各組藥物干預計劃見表1。藥物劑量采用等效劑量系數換算公式計算。D大鼠=D人×（HI大鼠/HI人）×（W人/W大鼠）2/3。注：D為劑量，HI為體型系數，W為體質量。各藥物灌胃劑量：通塞顆粒為 7.2 g·kg-1·d-1，補肺益腎方為 4.42 g·kg-1·d-1，鹽酸莫西沙星片為0.027 g·kg-1·d-1，硫酸沙丁胺醇片為0.41 mg·kg-1·d-1；每周稱量一次大鼠體質量，以調整灌胃用量。

表1 各組藥物干預計劃Table 1 Intervention plans of five groups of rats

1.8 取材與指標檢測 藥物干預結束后取材，取材前大鼠禁食12 h，自由飲水。采用3%戊巴比妥鈉（2.5 ml/kg）腹腔麻醉，氣管插管，檢測肺功能，隨后腹主動脈采血并取材。

1.8.1 體質量 每周稱量大鼠體質量（g）。

觀察組無效4例,有效19例,顯效9例,,總有效率87.5%,對照組無效14例,有效17例,顯效5例,總有效率56.25%,兩組比較差異有統計學意義(X2=2.52,p<0.05)。

1.8.2 肺功能造模 第0、1、4、8周和急性加重前分別使用WBP無束縛小動物全身體積描記儀檢測潮氣量（TV）、呼氣峰流速（PEF）、50%潮氣量呼氣流量（EF50）；取材前使用Fine PointeTM series PFT檢測FVC、FEV0.3，計算 FEV0.3/FVC。

1.8.3 肺、腸組織CD3+和CD4+表達水平 取左肺經左主支氣管恒壓灌注10%中性甲醛溶液2 h，然后置于新鮮配制的10%中性甲醛固定液中固定72 h。從肛門向上截取5 cm腸組織，清除其內容物，0.9%氯化鈉溶液洗2次，置于新鮮配制的10%中性甲醛固定液中固定72 h。分別切取3 mm組織，石蠟包埋，4 μm切片，常規HE染色。采用免疫組化試劑盒檢測CD3+和CD4+表達。

1.8.4 肺、腸組織sIgA表達水平 分別取右肺下葉100 mg組織和100 mg腸組織，用無菌剪剪碎，按1∶9比例加入0.9%氯化鈉溶液，放置于組織破碎機10 min進行充分勻漿，3 000 rpm離心10 min（r=5 cm），收集上清液。ELISA試劑盒檢測sIgA表達水平。

1.8.5 顯微鏡觀察 每張切片取6個視野（200×），采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（USA），以棕黃色區域光密度值（IOD）的平均值統計陽性結果。

1.9 統計學方法 采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統計并作圖。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用Tukey's法進行多重檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 對照組大鼠皮毛光滑，活動度正常，反應靈敏，進食量、進水量如常，糞便呈顆粒狀；其余組別大鼠皮毛光澤度下降，皮毛色澤偏黃，活動明顯減少、敏捷度下降、出現蜷縮現象，進食量、進水量減少，糞便稀溏不成形。藥物治療后的大鼠進食量、進水量增加，中西醫結合組大鼠的糞便逐漸形成顆粒狀。對照組、COPD組無大鼠死亡，其他組均出現2～3只大鼠死亡，尸檢可見死亡大鼠胸腔出現不同程度的肺淤血、肺體積增大，腹腔出現不同程度的粘連、血性積液。

2.2 體質量 各組大鼠體質量隨周齡增長，其他組別體質量全程低于對照組。第9周急性加重后，AECOPD組持續低增長，見圖1A。干預結束后，五組體質量比較，差異有統計學意義（F=88.74，P＜0.05）。COPD組體質量低于對照組，差異有統計學意義（q=16.320，P＜0.05）；AECOPD組體質量低于COPD組，差異有統計學意義（q=8.925，P＜0.05）；西藥組、中西醫結合組體質量高于AECOPD組，差異有統計學意義（q西藥組=9.026，q中西醫結合組=10.430，P＜0.05）；西藥組、中西醫結合組體質量比較，差異無統計學意義（q=1.912，P＞0.05），見圖 1B。

圖1 各組大鼠體質量變化Figure 1 Body weight change of rats in each group

2.3 肺功能 第0～8周，對照組大鼠的TV、PEF、EF50隨時間增長，其他組別TV、PEF、EF50全程低于對照組，見圖2A～C。第8周結束時，COPD組、AECOPD組、西藥組、中西醫結合組的TV、PEF、EF50低于對照組，差異有統計學意義（FTV=17.00，FPEF=43.69，FEF50=13.54，P＜0.05）；COPD組、AECOPD組、西藥組、中西醫結合組TV、PEF、EF50比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2D～F。

藥物干預結束時，五組大鼠的FEV0.3比較，差異有統計學意義（F=155.70，P＜0.05）。COPD組FEV0.3低于對照組，差異有統計學意義（q=20.070，P＜0.05）；AECOPD組FEV0.3低于COPD組，差異有統計學意義（q=11.310，P＜0.05）；西藥組、中西醫結合組FEV0.3高于AECOPD組，差異有統計學意義（q西藥組=16.750，q中西醫結合組=24.890，P＜0.05）；中西醫結合組 FEV0.3高于西藥組，差異有統計學意義（q=9.272，P＜0.05），見圖2G。

圖2 各組大鼠肺功能變化比較Figure 2 Changes of lung function of rats in each group

藥物干預結束時五組大鼠FVC比較，差異有統計學意義（F=83.73，P＜0.05）。COPD組FVC低于對照組，差異有統計學意義（q=16.190，P＜0.05）；AECOPD組FVC低于COPD組，差異有統計學意義（q=7.336，P＜0.05）；西藥組、中西醫結合組FVC高于AECOPD組，差異有統計學意義（q西藥組=13.040，q中西醫結合組=17.640，P＜0.05）；中西醫結合組FVC高于西藥組，差異有統計學意義（q=5.597，P＜0.05），見圖2H。

藥物干預結束時五組大鼠FEV0.3/FVC比較，差異 有 統 計 學 意 義（F=123.00，P＜0.05）。COPD組FEV0.3/FVC低于對照組，差異有統計學意義（q=10.560，P＜0.05）；AECOPD組FEV0.3/FVC低于COPD組，差異有統計學意義（q=16.630，P＜0.05）；西藥組、中西醫結合組FEV0.3/FVC高于AECOPD組，差異有統計學意義（q西藥組=17.400，q中西醫結合組=25.500，P＜0.05）；中西醫結合組FEV0.3/FVC高于西藥組，差異有統計學意義（q=9.275，P＜0.05），見圖 2I。

2.4 肺組織和腸組織sIgA表達水平 五組大鼠的肺組織sIgA表達水平比較，差異有統計學意義（F=700.20，P＜0.05）。COPD組大鼠肺組織sIgA表達水平低于對照組，差異有統計學意義（q=50.030，P＜0.05）；AECOPD組肺組織sIgA表達水平低于COPD組，差異有統計學意義（q=19.260，P＜0.05）；西藥組、中西醫結合組肺組織sIgA表達水平高于AECOPD組，差異有統計學意義（q西藥組=10.580，q中西醫結合組=16.000，P＜0.05）；中西醫結合組肺組織sIgA表達水平高于西藥組，差異有統計學意義（q=5.072，P＜0.05），見圖3A。

五組大鼠的腸組織sIgA表達水平比較，差異有統計學意義（F=1 113.00，P＜0.05）。COPD組大鼠腸組織sIgA表達水平低于對照組，差異有統計學意義（q=43.460，P＜0.05）；AECOPD組腸組織sIgA表達水平低于COPD組，差異有統計學意義（q=49.970，P＜0.05）；西藥組、中西醫結合組腸組織sIgA表達水平高于AECOPD組，差異有統計學意義（q西藥組=26.470，q中西醫結合組=34.530，P＜0.05）；中西醫結合組腸組織sIgA表達水平高于西藥組，差異有統計學意義（q=9.359，P＜0.05），見圖 3B。

圖3 各組大鼠sIgA表達水平比較Figure 3 Expression of sIgA in rats of each group

2.5 肺組織CD3+和CD4+表達水平 五組大鼠的肺組織CD3+表達水平比較，差異有統計學意義（F=96.39，P＜0.05）。COPD組大鼠肺組織CD3+表達水平低于對照組，差異有統計學意義（q=15.700，P＜0.05）；AECOPD組肺組織CD3+表達水平低于COPD組，差異有統計學意義（q=12.980，P＜0.05）；西藥組、中西醫結合組肺組織CD3+表達水平高于AECOPD組，差異有統計學意義（q西藥組=12.690，q中西醫結合組=16.120，P＜0.05）；中西醫結合組肺組織CD3+表達水平高于西藥組，差異有統計學意義（q=5.654，P＜0.05），見圖4A，圖4C～G。

圖4 各組大鼠肺組織CD3+和CD4+表達水平比較Figure 4 Expression of CD3+ and CD4+ in lung tissue of rats in each group

五組大鼠的肺組織CD4+表達水平比較，差異有統計學意義（F=418.80，P＜0.05）。COPD組大鼠肺組織CD4+表達水平低于對照組，差異有統計學意義（q=34.140，P＜0.05）；AECOPD組肺組織表達水平低于COPD組，差異有統計學意義（q=23.150，P＜0.05）；西藥組、中西醫結合組肺組織CD4+表達水平高于AECOPD組，差異有統計學意義（q西藥組=12.760，q中西醫結合組=16.160，P＜0.05）；西藥組、中西醫結合組肺組織CD4+表達水平比較，差異無統計學意義（q=3.776，P＞0.05），見圖4B，圖4H～L。

2.6 腸組織CD3+和CD4+表達水平 五組大鼠的腸組織CD3+表達水平比較，差異有統計學意義（F=174.10，P＜0.05）。COPD組大鼠腸組織CD3+表達水平低于對照組，差異有統計學意義（q=23.510，P＜0.05）；AECOPD組腸組織CD3+表達水平低于COPD組，差異有統計學意義（q=13.910，P＜0.05）；西藥組、中西醫結合組腸組織CD3+表達水平高于AECOPD組，差異有統計學意義（q西藥組=8.498，q中西醫結合組=11.460，P＜0.05）；西藥組、中西醫結合組腸組織CD3+表達水平比較，差異無統計學意義（q=3.288，P＞0.05），見圖5A，圖5C～G。

五組大鼠的腸組織CD4+表達水平比較，差異有統計學意義（F=90.66，P＜0.05）。COPD組大鼠腸組織CD4+表達水平低于對照組，差異有統計學意義（q=18.800，P＜0.05）；AECOPD組腸組織CD4+表達水平低于COPD組，差異有統計學意義（q=11.320，P＜0.05）；西藥組、中西醫結合組腸組織CD4+表達水平高于AECOPD組，差異有統計學意義（q西藥組=10.430，q中西醫結合組=13.240，P＜0.05）；西藥組、中西醫結合組腸組織CD4+表達水平比較，差異無統計學意義（q=3.348，P＞0.05），見圖5B，圖5H～L。

圖5 各組大鼠腸組織CD3+和CD4+表達水平比較Figure 5 Expression of CD3+ and CD4+ in intestinal tissue of rats in each group

3 討論

本實驗的模型組大鼠皮毛光澤度下降，皮毛色澤偏黃，表現出活動明顯減少、敏捷度下降、蜷縮現象，進食量、進水量減少，體質量增長速度緩慢，糞便稀溏不成形。藥物治療后的大鼠進食量、進水量增加，體質量較AECOPD組大鼠顯著增長，糞便逐漸形成顆粒狀。臨床重度和極重度COPD的常見癥狀包括腹脹便溏、形體消瘦、倦怠無力等［15-16］，對判斷預后具有重要價值［17］。肌肉量降低的COPD患者，在院內死亡率、住院天數、住院費用方面顯著高于非肌肉量降低的患者［18］。以上研究結果提示，中西醫結合治療COPD痰熱證急性加重-穩定期大鼠，能夠通過提高大鼠的進食、進水量，促進大鼠體質量增長，通過改善糞便狀態，緩解大鼠腹瀉表現，從而改善大鼠的生存質量。

本實驗于第8周結束后，模型組大鼠的TV、PEF、EF50顯著低于對照組；取材前，AECOPD組大鼠的FVC、FEV0.3和FEV0.3/FVC顯著低于西藥組和中西醫結合組，且中西醫結合組療效更顯著。COPD的特點是持續的呼吸道癥狀和氣流受限，臨床中的肺功能檢測是對氣流限制最具重復性和客觀性的測量方法［1］。本實驗中，模型大鼠的肺功能相關指標降低與臨床研究肺功能的變化一致，提示中西醫結合治療COPD痰熱證急性加重-穩定期，能夠通過提高肺功能從而改善大鼠的呼吸功能。

本實驗中，AECOPD組大鼠肺組織和腸組織中的sIgA表達水平顯著低于對照組，藥物治療可使肺組織和腸組織中sIgA表達水平升高，中西醫結合治療組的sIgA表達水平升高更顯著。COPD患者氣道表面普遍存在sIgA表達缺損［2］，與慢性細菌侵襲、中性粒細胞炎癥及COPD氣流阻塞的嚴重程度相關［3-4］。當呼吸道感染時，病原微生物入侵并黏附于上皮，刺激黏膜局部產生免疫應答，并通過黏膜免疫歸巢遷移的途徑影響傳變到腸道，使肺和腸道的sIgA的合成與分泌減少，黏膜局部抗感染能力較弱，又增加肺部病變。慢性炎癥與免疫機制相互交織，相互促進，形成惡性循環［19］。中西醫結合治療COPD痰熱證急性加重-穩定期大鼠，能夠顯著升高大鼠肺組織和腸組織中的sIgA表達水平，從而改善肺組織和腸組織的免疫屏障功能。

作者貢獻：李曉俊、李亞進行研究設計與實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負責；卞晴晴、軒銀霜、沈婷婷參與動物飼養、干預、取材、實驗數據記錄；李素云進行質量控制。

本文無利益沖突。