亞甲基四氫葉酸脫氫酶2與腫瘤表型關(guān)系的研究進(jìn)展

黃美慧，許圳南，薛家健，杜則澎，許海雄，劉明發(fā)，*

(1．汕頭市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515031；2．汕頭市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 汕頭515031)

惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，是多基因、多種信號通路以及細(xì)胞代謝改變等多因素共同參與導(dǎo)致的一種病理改變，死亡率較高，嚴(yán)重威脅著人民群眾的生命健康。腫瘤細(xì)胞處于快速分裂增殖過程，對于能量的需求明顯高于正常組織，因而腫瘤細(xì)胞可以通過改變自身代謝過程來適應(yīng)生存。眾所周知，一碳代謝的異常可以滿足腫瘤細(xì)胞對高增殖率和生存的需求[1]。一碳代謝包括葉酸循環(huán)和甲硫氨酸循環(huán)，可以產(chǎn)生一碳單位，用于核苷酸的合成、DNA甲基化反應(yīng)和還原性代謝過程。

亞甲基四氫葉酸脫氫酶2(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2，MTHFD2)屬于MTHFD家族(包含MTHFD1L、MTHFD1、MTHFD2L和MTHFD2)的成員，在腹水腫瘤細(xì)胞中首次被發(fā)現(xiàn)，不同于胞質(zhì)中以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作為輔酶的MTHFD1，MTHFD2主要依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)[2]。MTHFD2由 一 個(gè)功能性前體失去合成酶的結(jié)構(gòu)域形成[3]，具有亞甲基四氫葉酸脫氫酶和甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶的雙重酶活性，在線粒體一碳代謝途徑中，可以將亞甲基四氫葉酸氧化為10-甲酰四氫葉酸[4]。在快速增殖的細(xì)胞中，MTHFD2活性較高，與葉酸代謝等途徑中的其他分子共同表達(dá)升高，使嘌呤、三磷酸腺苷、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的含量增加，從而促進(jìn)細(xì)胞的快速增殖[5]。Nilsson等[6]分析了19種癌癥(共1 981例人類腫瘤樣本)的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)MTHFD2是1 454種代謝酶中表達(dá)上調(diào)最為穩(wěn)定的酶，這些均提示了MTHFD2在惡性腫瘤中可能發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。因此，本文就MTHFD2在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移侵襲、死亡及其臨床意義等方面的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 MTHFD2的結(jié)構(gòu)、定位及表達(dá)

人類MTHFD2(別名NMDMC)基因定位于2p13.1染色體，基因全長16 736 bp，含9個(gè)外顯子，8個(gè)內(nèi)含子。MTHFD2蛋白由350個(gè)氨基酸構(gòu)成，相對分子質(zhì)量約為37 kD。MTHFD2為二聚體結(jié)構(gòu)，其X-射線晶體結(jié)構(gòu)顯示，該蛋白由兩個(gè)長α螺旋連接兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，并由一個(gè)小的D2螺旋在兩結(jié)構(gòu)域之間形成一個(gè)大縫隙，配體的結(jié)合位點(diǎn)則位于大縫隙中[7]。可結(jié)合的配體包括NAD+、無機(jī)磷酸鹽和LY345899。

MTHFD2主要定位在線粒體，在線粒體中發(fā)揮脫氫酶活性作用，為核苷酸合成和其他甲基化反應(yīng)提供一碳單位[8]。而Sheppard等[9]通過亞細(xì)胞分離技術(shù)發(fā)現(xiàn)，MTHFD2還可以定位在細(xì)胞核，且與DNA復(fù)制位點(diǎn)相同；Liu等[10]同樣證實(shí)了MTHFD2可以定位于細(xì)胞核，并參與細(xì)胞周期調(diào)控，但是對于細(xì)胞核內(nèi)MTHFD2發(fā)揮的更多潛在功能仍不清楚。

值得注意的是，MTHFD2在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)，在大多數(shù)正常成人組織中很少或者不表達(dá)[4]，但MTHFD2在乳腺癌、肺癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中較正常癌旁組織的表達(dá)均升高[11-14]，且與這些腫瘤的預(yù)后不良密切相關(guān)。Koufaris等[15]研究者利用放線菌酮處理細(xì)胞，驗(yàn)證了MTHFD2的半衰期明顯低于其他一碳代謝酶；另外，MTHFD2可被生長因子誘導(dǎo)表達(dá)。所以理論上MTHFD2抑制劑的作用相比于其他一碳代謝途徑抑制劑如甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)更具有選擇性[16]，MTHFD2可能是癌癥治療的安全靶標(biāo)[17]。

2 MTHFD2與腫瘤表型關(guān)系的研究

惡性腫瘤具有持續(xù)性增殖、異常信號通路激活、凋亡減弱、細(xì)胞能量異常、基因組不穩(wěn)定、持續(xù)的血管生成、組織的浸潤與轉(zhuǎn)移等表型特征，其中一碳代謝的異常可顯著影響腫瘤細(xì)胞的惡性表型[1]。近年來，研究表明MTHFD2在多種腫瘤比如乳腺癌、肝癌和結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，且在腫瘤中能夠作為獨(dú)立預(yù)后因子，與預(yù)后不良相關(guān)。此外，MTHFD2表達(dá)的缺失，可以消除腫瘤的惡性表型，如增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移等[18]。值得探討的是，本課題組研究MTHFD2在惡性膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)功能及機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)MTHFD2可能與惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖等生物學(xué)功能密切相關(guān)(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。

2.1 MTHFD2與細(xì)胞增殖

腫瘤細(xì)胞的持續(xù)性增殖能力，是腫瘤惡性進(jìn)展的指標(biāo)之一，臨床中常用的TNM分期中的T是指腫瘤的大小。Huang等[11]利用報(bào)告基因和集落形成等實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌MCF-7細(xì)胞中MTHFD2顯著過表達(dá)后，蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)活性增強(qiáng)進(jìn)而促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖和集落形成。而Lehtinen等[19]則發(fā)現(xiàn)，MTHFD2對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖并不產(chǎn)生明顯影響。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，MTHFD2水平增加引起S期細(xì)胞比例增加，細(xì)胞增殖加快，反之則細(xì)胞增殖減慢[14]。在卵巢癌中，Li等[13]發(fā)現(xiàn)抑制MTHFD2表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白B1/細(xì)胞分裂周期基因2復(fù)合物活性降低，引起G2/M期阻滯，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。在非小細(xì)胞肺癌中，Yu等[12]通過生物信息學(xué)分析并證實(shí)了MTHFD2敲降后，細(xì)胞周期蛋白A2、微小染色體維持蛋白7和S期激酶相關(guān)蛋白2的表達(dá)水平下調(diào)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。在鼻咽癌中，MTHFD2敲降后，明顯抑制HK1、HNE1和6-10B細(xì)胞的增殖和集落形成能力[20]。但是，MTHFD2對肝癌細(xì)胞的增殖和周期分布無顯著作用[21]。由此可見，MTHFD2對腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響并不一致，而因腫瘤類型或細(xì)胞類型的不同而作用不同。

2.2 MTHFD2與細(xì)胞遷移和侵襲

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程對于腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移是必不可少的[22]。多項(xiàng)研究表明，MTHFD2主要通過調(diào)節(jié)EMT和/或EMT相關(guān)信號通路的變化參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過程。Liu等[21]的研究顯示，肝癌細(xì)胞Huh-7和HepG2中MTHFD2的表達(dá)被抑制后，上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)水平升高，間葉標(biāo)志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)水平降低，EMT過程受阻，導(dǎo)致細(xì)胞遷移和侵襲能力減弱。Shi等[23]在肺腺癌細(xì)胞H1299和H1975中敲降MTHFD2后，發(fā)現(xiàn)EMT的變化與在肝癌中的研究結(jié)果類似，即EMT過程被抑制。隨后該團(tuán)隊(duì)通過基因集富集分析和Western-blot技術(shù)驗(yàn)證了MTHFD2可以激活A(yù)KT/糖原合成激酶3β/β-連環(huán)蛋白信號通路進(jìn)而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的遷移。在卵巢癌細(xì)胞SKOV3和OVCAR8中，Li等[13]利用Western-blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)MTHFD2表達(dá)下調(diào)引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化蛋白3誘導(dǎo)的EMT過程受阻，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展。

血管生成是指新生血管形成的過程，在腫瘤惡性進(jìn)展中起著重要作用。Hitzel等[24]團(tuán)隊(duì)在研究用氧化磷脂處理內(nèi)皮細(xì)胞后的代謝重編程過程中，通過建立貝葉斯(Bayesian)網(wǎng)絡(luò)模型發(fā)現(xiàn)了MTHFD2這一關(guān)鍵驅(qū)動因子；后續(xù)利用體外小鼠類器官模型，發(fā)現(xiàn)用siRNA敲降MTHFD2后，血管形成減少，若同時(shí)加入甘氨酸處理，血管形成能力有所恢復(fù)，表明依賴于MTHFD2的甘氨酸合成是血管生成所必備的；此外，該團(tuán)隊(duì)在斑馬魚胚胎中敲降MTHFD2后，斑馬魚胚胎脈管系統(tǒng)的形態(tài)發(fā)生異常，進(jìn)一步確認(rèn)了MTHFD2對血管生成的重要性。血管生成在一定程度上與腫瘤的進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[25]，MTHFD2極有可能通過參與代謝的重編程影響血管的生成，從而加速腫瘤的惡性進(jìn)展過程。以上研究均提示MTHFD2在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲方面具有較一致的促進(jìn)作用，但是由于腫瘤細(xì)胞所處微環(huán)境的復(fù)雜性，MTHFD2調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制各不相同，仍需深入研究。

2.3 MTHFD2與細(xì)胞死亡

細(xì)胞死亡如凋亡、壞死、自噬等是被周密調(diào)控的復(fù)雜過程[26]。在持續(xù)的外界或自身不良因素作用下，細(xì)胞死亡的調(diào)控被打亂，異常的細(xì)胞可能會出現(xiàn)增殖加快，死亡減少等現(xiàn)象，最后導(dǎo)致細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)變。在卵巢癌中敲降MTHFD2表達(dá)后采用凋亡檢測顯示凋亡細(xì)胞比例明顯增加[13]。在肺腺癌中，Shi等[23]在體內(nèi)外，分別利用流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL實(shí)驗(yàn)證明，MTHFD2敲降后，肺腺癌細(xì)胞PC-9和H1975凋亡顯著增加。同樣地，在結(jié)直腸癌RKO和SW-480細(xì)胞中過表達(dá)MTHFD2后，與對照組比較，過表達(dá)MTHFD2組中凋亡細(xì)胞顯著減少[14]；但也有報(bào)道[21]表明，MTHFD2對肝癌細(xì)胞的凋亡并不產(chǎn)生顯著影響，提示MTHFD2對凋亡的影響可能跟腫瘤類型相關(guān)。然而MTHFD2對其他細(xì)胞死亡形式的作用鮮少報(bào)道，有待深入探索挖掘。

2.4 MTHFD2與腫瘤治療

因MTHFD2是一碳代謝中的主要酶之一，且其生物學(xué)功能不斷被挖掘，研究者開始致力于探索其在治療上的作用。在肝癌細(xì)胞中，Liu等[21]發(fā)現(xiàn)抗腫瘤代謝藥物MTX不僅能夠降低MTHFD2的表達(dá)，同時(shí)在MTHFD2敲降的細(xì)胞中用MTX處理后，細(xì)胞的增殖活性降低更顯著。Lin等[2]在腎癌細(xì)胞中做了類似的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在MTHFD2敲降的786-O細(xì)胞中，用MTX或5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)處理后，細(xì)胞增殖活性被顯著抑制。這在一定程度上表明，MTHFD2的表達(dá)與化療藥物MTX和5-FU的敏感性值得被關(guān)注。

DS18561882是一種可口服的MTHFD2特異性抑制劑，Lee等[27]將DS18561882與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1抑制劑結(jié)合起來，在體內(nèi)外驗(yàn)證了二者協(xié)同誘導(dǎo)三陰乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用。Ju等[28]構(gòu)建了結(jié)直腸癌人源性異種移植小鼠模型，并使用MTHFD2抑制劑LY345899處理，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長受到抑制、細(xì)胞凋亡增加、腸系膜轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯減少。Bonagas等[29]在體內(nèi)急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)動物模型上，應(yīng)用強(qiáng)效MTHFD2小分子抑制劑TH9619，并與AML的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物阿糖胞苷(cytosine arabinoside，AraC)的效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)TH9619處理的小鼠體質(zhì)量未發(fā)生改變且生存時(shí)間更長，而AraC處理的小鼠體質(zhì)量減輕，提示TH9619在體內(nèi)的毒性更小。Yang等[30]制備了一種新型的納米平臺，以酮縮硫醇交聯(lián)的氟化聚乙烯亞胺作為基因載體，形成包含MTHFD2和谷胱甘肽過氧化酶4敲降質(zhì)粒的活性氧反應(yīng)納米顆粒，并利用這兩種顆粒的促凋亡和誘導(dǎo)鐵死亡的作用共同處理癌細(xì)胞，在理論上安全有效且毒性小。這些報(bào)道為MTHFD2作為惡性腫瘤治療靶標(biāo)，將其抑制劑或敲降質(zhì)粒用于惡性腫瘤的臨床治療提供了有力證據(jù)和思路。

3 小結(jié)與展望

MTHFD2作為一碳代謝途徑中至關(guān)重要的酶，其功能活躍，與核苷酸合成、NADPH產(chǎn)生和氧化還原防御等密切相關(guān)。MTHFD2在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，且與患者的預(yù)后相關(guān)，但其分子機(jī)制各不相同，甚至有個(gè)別報(bào)道表明，MTHFD2很有可能不依賴其酶活性參與到腫瘤的惡性進(jìn)展中。因此，在惡性腫瘤中，MTHFD2很有可能是具有雙重功能的蛋白，在特定的腫瘤微環(huán)境通過影響著腫瘤的惡性表型，進(jìn)而影響腫瘤的惡性進(jìn)展。

另外，影響腫瘤代謝是抗腫瘤藥物研發(fā)的重要環(huán)節(jié)，盡管已經(jīng)有MTHFD2相關(guān)抑制劑的報(bào)道，但是應(yīng)用到腫瘤本身的體內(nèi)外研究仍較少，MTHFD2抑制劑的發(fā)現(xiàn)、制備以及在MTHFD2高表達(dá)的腫瘤中對其有效性和毒性進(jìn)行體內(nèi)外的驗(yàn)證等問題，仍需進(jìn)一步深入探討。MTHFD2若真正應(yīng)用到臨床，亟需解決的問題還較多。例如，MTHFD2作為一碳代謝的主要酶類，能否直接作為臨床上的靶標(biāo)；了解MTHFD2酶活性缺如狀態(tài)下生物學(xué)功能改變的具體機(jī)制；以及解決MTHFD2抑制劑的臨床應(yīng)用等難題。總之，以MTHFD2為靶標(biāo)以及以干擾腫瘤異常代謝為目的的治療方法，勢必成為未來惡性腫瘤預(yù)防診斷以及治療的新策略，真正的完善還需要更多的研究。