藥桑葉具α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性部位篩選及酶動力學研究

賀水花 ，宋毅，李海平 ，曹慧敏 ，楊玲*

（1塔里木大學生命科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

2021年，全球大約有5.37億20—79歲的成年人患有糖尿病［1］，糖尿病已成為當今嚴重和常見的慢性疾病之一。近年來，從中草藥資源中尋找降糖效果好，且對機體無副作用的新型天然植物α-葡萄糖苷酶抑制劑逐漸成為研究熱點之一［2-4］。α-葡萄糖苷酶抑制劑可通過抑制小腸內糖苷酶活性，延遲消化攝入的碳水化合物從而減少葡萄糖的吸收來控制血糖水平［3］。研究α-葡萄糖苷酶抑制劑抑制機制，對于α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發及應用具有重要的理論和實踐意義。

藥桑作為一種藥食同源性植物［5］，是維吾爾族的民間降血糖藥物［6-7］。郝蒙蒙等［8］研究發現藥桑葉中提取的粗黃酮、粗多糖和粗生物堿均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，且粗生物堿及高濃度的粗多糖抑制活性較強；王賀［9］優化了藥桑葉生物活性物質提取純化工藝的6個單因素條件，按優化工藝所提取純化的粗生物堿、粗多糖和粗黃酮的α-葡萄糖苷酶抑制活性表現為粗生物堿>粗多糖，與郝蒙蒙的研究結果一致。查閱文獻，目前尚未有關于藥桑葉的α-葡萄糖苷酶動力學機制研究，本試驗基于α-葡萄糖苷酶-pNPG體外反應體系探究了藥桑葉提取物不同活性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制效果，并采用萊恩威弗-伯克(Lineweaver-Burk)模型對抑制活性較好的部位進行具體的酶動力學研究，將為藥桑葉的α-葡萄糖苷酶抑制劑藥用開發提供試驗數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥桑葉采自新疆和田（79°92'E，37°12'N），由塔里木大學邱愛軍副教授鑒定為藥桑(Morus nigraL.)的植物葉。

阿卡波糖片(50 mg/片)，德國拜耳醫藥有限公司；α-葡萄糖苷酶（酵母源），江蘇瑞陽生物科技有限公司；對硝基苯-α-D-葡萄糖苷(pNPG)、對硝基苯酚（p-Nitrophenol，PNP），上海麥克林生化科技有限公司；所有萃取使用的有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

酶標分析儀(配有405 nm濾光片)，南京德鐵實驗設備有限公司；電熱恒溫水浴鍋(配有384個EP管插孔)，北京市永光明醫療儀器有限公司；CP224C電子天平，美國奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藥桑葉各活性部位的制備

將采集的藥桑葉自然陰干后取5 kg碾碎，80%乙醇室溫浸提，間歇性攪拌，浸提3次，每次24 h，將所得濾液濃縮，真空冷凍干燥得到粘稠狀藥桑葉粗浸膏；取1 kg粗浸膏混懸于5 L蒸餾水中，按混懸液∶萃取劑為1∶1的比例，根據萃取劑極性由小到大的次序將混懸液依次萃取3次，得到石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和剩余水相部位，真空冷凍干燥各萃取部位備用。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶的抑制活性篩選

結合微孔板法［10］，參照王賀［9］研究方法，以pNPG為底物的酶-抑制劑篩選模型略加改動，測定藥桑葉不同活性萃取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。本試驗設置空白組、實驗組以及背景組，其中實驗組包括阿卡波糖對照組，每組6孔。為使試驗結果更為可靠，調整各組濃度使其抑制率曲線均通過50%。剩余水相部位，粗浸膏，正丁醇萃取部位，阿卡波糖濃度梯度均為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL；乙酸乙酯萃取部位，石油醚萃取部位濃度梯度均為0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6 mg/mL。按照表1準確移取0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 6.8)，適宜濃度梯度樣品（使抑制率曲線過IC50為宜），1.25 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液于1.5 mL EP管中后震蕩混勻，37℃溫育15 min后加入2 mmol/L pNPG，反應20 min，加入0.2 mol/L Na2CO3終止反應。移取200 mL反應終止液至96微孔板中于405 nm［11］處測定各吸光度值（A）。每個處理組各重復3次，取各組吸光度平均值代入公式（1）計算α-葡萄糖苷酶抑制率：

表1 α-葡萄糖苷酶活性抑制體系 μL

1.3.3 標準曲線的繪制

以α-葡萄糖苷酶-pNPG酶促體系有色產物PNP作標準曲線，分別取濃度為0 μmol/mL、20 μmol/mL、40 μmol/mL、80 μmol/mL、100 μmol/mL、200 μmol/mL、300 μmol/mL、400 μmol/mL、1 000 μmol/mL PNP溶液各 50 μL，加入 0.2 mol/L 的 Na2CO3400 μL，渦漩混勻，在405 nm下測定吸光度值，縱坐標為吸光度值，橫坐標為PNP濃度，分析可得線性回歸方程。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制作用動力學實驗

1.3.4.1 酶促反應初速率時間范圍測定

按照1.3.2的方法測定2.0 mmol/L pNPG溶液在不同酶活力（0.8 U/mL、1.0 U/mL、1.2 U/mL、1.4 U/mL、1.6 U/mL、1.8 U/mL、2.0 U/mL）條件下的酶促反應初速率。測定方法為每隔2 min測定一次反應體系吸光度值，以酶反應時間為橫坐標，PNP的吸光度值為縱坐標，使用Origin軟件進行擬合得到酶反應進程曲線，擬合曲線中產物PNP勻速增加階段對應的時間范圍即為酶的初速率時間范圍。

1.3.4.2 剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶抑制類型的研究

在1.3.4.1測定的初速率時間范圍內，考察剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶活力的影響，以酶活力為橫坐標，反應初速率為縱坐標作圖，根據抑制動力學曲線特點判斷其可逆或不可逆抑制類型［12］。反應體系中各物質濃度為剩余水相部位0.0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL，pNPG 2.0 mmol/L，α-葡萄糖苷酶0.8 U/mL、1.0 U/mL、1.2 U/mL、1.4 U/mL、1.6 U/mL、1.8 U/mL。

測定樣品濃度為0.0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL，α-葡萄糖苷酶活力為1.8 U/mL，pNPG濃度為1 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L、8 mmol/L、16 mmol/L的反應初速率。以pNPG濃度的倒數為橫坐標，反應初速率的倒數為縱坐標，繪制Lineweaver-Burk曲線，通過二次作圖，得出剩余水相部位與α-葡萄糖苷酶的解離常數為KSI（抑制劑濃度與斜率作圖，所得直線與橫坐標交點的絕對值）及剩余水相部位與α-葡萄糖苷酶-底物復合物的解離常數為KII（抑制劑濃度與截距作圖，所得直線與橫坐標交點的絕對值），根據Lineweaver-Burk曲線特征及KSI、KⅡ大小判斷其具體抑制類型，分析其抑制作用機制。

1.4 數據統計分析

使用Origin 2018及SPSS 25.0軟件進行數據處理分析及作圖，得到相應的半抑制濃度（IC50），顯著性檢驗采用單因素方差分析（Duncan）法，P<0.05。

2 結果與分析

2.1 PNP標準曲線

使用Origin作圖并得到線性回歸方程y=0.054+0.855x，r2=0.999 4，如圖1所示。

圖1 PNP標準曲線

2.2 藥桑葉各活性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制活性篩選

由圖2分析可知，藥桑葉各活性部位對α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，在實驗濃度范圍內，質量濃度升高，抑制效果增強。

圖2 藥桑葉各活性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制活性分析

由圖3可知，以IC50（抑制50%酶活性所需的抑制劑濃度，IC50值越小，抑制作用越強）為評判標準，藥桑葉不同活性部位的半抑制率表現為阿卡波糖萃取部位（0.214±0.020）mg/mL>剩余水相部位（0.394±0.030）mg/mL>正丁醇萃取部位(0.527±0.02)mg/mL>粗浸膏(0.532±0.038)mg/mL>石油醚萃取部位(0.736±0.051)mg/mL>乙酸乙酯萃取部位(1.17±0.051)mg/mL；除正丁醇萃取部位與粗浸膏無顯著差異外，其余各組抑制活性均差異顯著。其中，剩余水相部位的抑制活性最強，但弱于阿卡波糖。

圖3 藥桑葉各活性部位的半抑制率及顯著性分析

2.3 剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶的抑制類型

根據2.2的篩選結果，剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶的抑制效果較好，故針對此活性部位進行酶動力學研究，來闡明剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶的抑制機制。

2.3.1 酶活力初速度時間范圍確定

由圖4可知，0.8～2.0 U/mL酶活力的酶促反應各進程曲線在4～14 min進行線性擬合，r2均達到0.999，呈勻速增加狀態，故確定初速率測定采樣時間范圍為4～14 min。

圖4 不同活力α-葡萄糖苷酶的酶促反應動力學進程曲線

2.3.2 剩余水相部位可逆或不可逆抑制類型的確定

由圖5可知，剩余水相部位濃度為0.0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL時，α-葡萄糖苷酶活力的抑制動力學曲線均通過原點，且0.4 mg/mL的剩余水相部位比0.0 mg/mL，0.2 mg/mL對應的動力學曲線的斜率低，反應初速率減小，可判斷剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶抑制類型為典型的可逆抑制。

圖5 剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶活力的抑制動力學曲線

2.3.3 剩余水相部位競爭性、非競爭性、反競爭性和混合型抑制類型的確定

由圖6a可知在此實驗條件下，剩余水相部位濃度越高，其對應的雙倒數曲線的橫截距越小，縱截距越大，所有直線在第二象限相交，可判斷該動力學曲線符合線性混合型抑制動力學曲線的特點［13］，抑制劑濃度增高，酶反應的最大反應速率（Vmax）降低（縱截距為），米氏常數（Km）升高。

由圖6b、圖6c可知，KSI為0.04 mg/mL，KII為0.29 mg/mL，KII>KSI，屬于混合型抑制中的競爭抑制作用大于非競爭抑制作用類型［14］，具體動力學參數如表2所示。根據此種抑制類型的底物-酶-抑制劑機理，分析可知剩余水相部位可同時通過兩種途徑來調控產物葡萄糖的產量，主要以與游離α-葡萄糖苷酶結合的方式來抑制α-葡萄糖苷酶對底物pNPG的水解，減少產物葡萄糖的生成；其次剩余水相部位也能與α-葡萄糖苷酶-底物復合物結合，延長產物葡萄糖的生成時間，從而可達到延緩血糖升高的目的。

圖6 剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶具體抑制類型曲線分析結果

表2 剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學參數

3 結論與討論

本試驗通過對藥桑葉各活性部位進行較為系統的體外α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選，結果表明：以IC50值為比較標準，對α-葡萄糖苷酶抑制活性大小為阿卡波糖>剩余水相部位>正丁醇萃取部位>粗浸膏>石油醚萃取部位>乙酸乙酯萃取部位；活性較強的剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為線性混合型抑制，且其競爭抑制作用大于非競爭抑制作用，表明藥桑葉剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶的親和力比酶的正常底物pNPG大，主要是以與游離α-葡萄糖苷酶結合的方式來延緩α-葡萄糖苷酶對底物pNPG的水解。本試驗為擴大藥桑藥用部位及其藥用資源的進一步開發利用提供理論依據。

前人對藥桑的研究主要集中在藥桑葚、藥桑枝、藥桑葉中的乙酸乙酯相與正丁醇相的研究，通過本試驗初步探究得知藥桑葉醇提浸膏經萃取液依次萃取后的剩余水相部位體外α-葡萄糖苷酶抑制效果較好，有必要進一步探究其生物活性物質的具體化學成分，研究主要的α-葡萄糖苷酶抑制活性單體化合物及化合物之間的協同效應，并進行體內降血糖實驗，以期制備出純度高、效果佳、用量少的天然α-葡萄糖苷酶抑制劑。