膠原蛋白改性聚乳酸-羥基乙酸載藥納米纖維膜的制備及其性能

吳煥嶺， 謝周良， 汪 陽， 孫萬超， 康正芳， 徐國華

(1.鹽城工學院 紡織服裝學院， 江蘇 鹽城 224051； 2.鹽城市權航科技有限公司， 江蘇 鹽城 224056； 3.鹽城創能新屏蔽材料有限公司， 江蘇 鹽城 224043)

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)具有優異的生物相容性和體內降解性，在體內可通過水解作用全部降解，且具有非常好的可塑成型性，能夠用于藥物載體材料、醫用組織工程材料等領域。為了實現較高且穩定的力學性能，一般采用中、高分子質量PLGA材料制備組織工程支架材料。與此同時，這些支架材料的降解速率緩慢，但在體內降解周期較長，有些可長達6個月以上[1-2]，在體內長期留存將產生潛在機體排異和組織炎癥等副作用。另外，由于PLGA較強的疏水性，將其用于藥物傳遞材料時常常會出現藥物釋放速率慢、藥物累積釋放量低等問題。

基于構效關系與表界面作用理論[3-5]，通過復配調控方式將不同材料的分子鏈從分子水平進行重排，能夠減弱高聚物大分子之間的作用力，改變材料的親疏水性和降解性，也會對細胞在生物材料表面的黏附增殖性能產生較大影響。有研究表明，低分子質量與高分子質量的聚己內酯(PCL)通過共混靜電紡絲的方式，能夠有效改善高分子質量PCL納米纖維膜的降解性[6]。也有研究顯示：借助靜電紡絲技術制備PLGA、膠原蛋白復合纖維膜，可用于修復硬腦膜支架材料[7]、骨材料[8]和縫線材料[9]，能夠顯著提高PLGA材料的降解速率。原因在于膠原蛋白的引入能夠提高PLGA的親水性和生物相容性[10]，易于水分子的滲透和降解反應的發生。

在藥物載體應用方面，將藥物載入特定的有機或無機材料中，再置于腫瘤部位，能夠在腫瘤部位富集較高濃度的藥物，實現藥物的長效、精確輸送，降低給藥頻率，且避免口服藥的首關效應及全身性毒副作用[11-13]。近年來，靜電紡絲技術飛速發展，由于該技術所制備的納米纖維具有比表面積高、孔隙率高等優點，已經成為制備納米纖維最簡單高效的技術之一，并廣泛用于藥物緩釋材料和組織工程支架材料等領域[14-15]。基于以上分析，為改善PLGA基藥物載體的降解性能和釋藥性能，本文以PLGA為基材，以膠原蛋白(Col)為改性材料，以鹽酸阿霉素(DOX·HCl，文中均簡寫為DOX)為藥物模型，利用靜電紡絲技術制備PLGA/Col/DOX復合載藥納米纖維膜，作為乳腺癌局部治療藥物緩釋材料使用，并對其結構和性質進行表征與分析。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

材料：聚乳酸-羥基乙酸(重均分子質量為120 000～160 000)，濟南岱罡生物工程有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH值為7.4)，南京森貝伽生物科技有限公司；透析袋(截留相對分子質量為2.5×104)，上海吉至生化科技有限公司；鹽酸阿霉素(純度為98%)、牛跟腱I型膠原蛋白、六氟異丙醇(HFIP，純度為99.5%)，上海麥克林生化科技有限公司；噻唑藍(MTT)胰酶，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；二甲基亞砜，國藥集團化學試劑有限公司；DMEM 高糖培養基、胎牛血清，Hyclone公司；小鼠成纖維細胞L929，中國科學院。

1.2 靜電紡絲溶液的配制與纖維制備

1.2.1 DOX、PLGA和Col溶液的制備

以HFIP作為DOX、PLGA、Col的溶劑，分別配制質量濃度為0.1 g/mL PLGA溶液150 mL、0.01 g/mL DOX溶液10 mL和0.1 g/mL Col溶液20 mL。

1.2.2 紡絲液的復配

將不同溶液組分按照表1所示的體積比進行混合，并充分攪拌均勻，分別得到PLGA、PLGA/Col、PLGA/DOX、PLGA/Col/DOX 4種紡絲溶液[16]。

表1 紡絲液的復配組分Tab.1 Composition of spinning solution

1.2.3 靜電紡納米纖維膜的制備

將配制的紡絲液通過DP30-S型靜電紡絲機進行紡絲。紡絲條件為：溫度25 ℃，相對濕度45%，電壓18 kV，接收板與噴絲頭距離14～16 cm，溶液流速為1.2 mL/ h，接收基材為鋁箔紙。每個樣品紡制平行樣3份，每份紡絲時長均為1 h[16]。

1.3 測試與表征

1.3.1 纖維形貌觀察

利用Nova Nano-450型場發射掃描電子顯微鏡觀察納米纖維膜樣品的外觀形貌，測試前先將納米纖維膜連同其所附著的錫箔紙一同裁剪成0.5 cm × 0.5 cm尺寸大小，用導電膠粘貼到專用載物臺上，并進行噴金處理45 s。

1.3.2 力學性能測試

將待測納米纖維膜從烘箱中取出，先裁成2 cm×7 cm規格，再揭除錫箔紙只留下納米纖維膜，采用WDS-20型斷裂強力測試儀測試試樣的力學性能。測試環境為：溫度20 ℃，相對濕度65%。樣品測試參數為：夾持長度5 cm，拉伸速率25 cm/min。

1.3.3 接觸角測試

將納米纖維膜連同其所附著的錫箔紙一同裁剪成2 cm × 2 cm規格，平鋪并固定在JCY-2型接觸角測試儀工作臺上，測試并讀數。測試參數：液滴體積3 μL，采用去離子水。

1.3.4 化學結構表征

采用NEXUS-670型傅里葉變換紅外光譜儀對納米纖維膜進行化學結構測試，掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.3.5 熱分析

采用STA-449C型TG-DSC同步熱分析儀分別對不同納米纖維膜進行降解性能測試。測試環境為N2氣氛，升溫速率為10.0 ℃/min，溫度范圍為50～800 ℃。

1.3.6 體外降解實驗及降解性能測試

利用質量損失法分別對膠原改性前后的納米纖維膜進行降解性能測試。具體過程為：首先，精確稱量納米纖維膜25 mg并裝入透析袋中封口，再置于50 mL離心管底部，隨后向離心管注入25 mL PBS緩沖溶液，并設置3份平行樣；然后，將試樣置于恒溫水浴振蕩搖床中，在37 ℃、100 r/min的條件下分別恒溫振蕩降解0、3、7、15、22和30 d；最后，稱量降解后的質量，通過下式計算質量損失率：

式中：m0為納米纖維膜降解前的質量，mg；mt為納米纖維膜降解后的質量，mg。

1.3.7 體外釋藥性測試

將恒溫振蕩搖床預先設置為37 ℃、100 r/min，備用。精確稱量Col改性前后的納米纖維膜25 mg并裝入透析袋中封口，再置于50 mL離心管底部，隨后向離心管注入25 mL PBS緩沖溶液，并設置3份平行樣。用封口膜將離心管密封完好，之后迅速置于恒溫振蕩搖床中。在一定的時間間隔從樣品離心管中吸取2 mL待測溶液，并及時補充2 mL新鮮PBS溶液。將取出溶液避光保存，并在2 h內使用UV1 810 S型紫外分光光度計將取出的樣品溶液在480.0 nm(鹽酸阿霉素的最大吸收波長)處測試其吸光度(A)，并結合DOX的標準曲線計算釋藥濃度(C)和藥物累計釋放量。

1.3.8 細胞相容性測試

參照ISO 10993《生物相容性測試標準(生物學評價)》和GB/T 16886—2022《醫療器械生物學評價》進行測試。通過PT-3502型酶標儀測試570 nm(甲瓚的最大吸收波長)下吸光度值來反映細胞在不同膜材料上的黏附增殖能力。

2 結果與討論

2.1 微觀形貌分析

采用場發射掃描電鏡觀察所制備的不同納米纖維膜的表面形貌，結果如圖1所示?？梢?，纖維均呈現出清晰的網狀交織結構。PLGA、PLGA/Col和PLGA/Col/DOX復合載藥納米纖維膜的單根纖維直徑均在200～500 nm范圍內，但呈現出逐漸變細的趨勢，表明相同質量納米纖維膜的比表面積在逐漸增大。對比來看，PLGA納米纖維形貌最均勻，PLGA/Col/DOX復合載藥納米纖維最不規整，出現了少部分粘連現象?？傮w上，PLGA與膠原蛋白以體積比3:1進行復合后，仍可達到均勻紡絲的效果。

圖1 不同納米纖維膜的掃描電鏡照片Fig.1 SEM images of different nanofibrous membranes

2.2 力學性能分析

表2示出改性前后納米纖維膜的力學性能測試結果。可知，未改性未載藥PLGA納米纖維膜的拉伸斷裂強度和彈性模量在3個樣品中均最高，分別為5.22與180.3 MPa，說明其發生單位形變所需要的力最大。PLGA/Col復合納米纖維膜具有最高的斷裂伸長率，為63.6%，說明膠原的加入能夠改善PLGA纖維的形變能力。但隨著藥物的載入，納米纖維膜的拉伸斷裂強度、斷裂伸長率和彈性模量等均發生明顯下降。分析原因可能是DOX藥物的分子質量小，其在一定程度上破壞了PLGA大分子的有序排列，因此，在材料使用時應根據使用性能的需要匹配相應的復配比例，以獲取適當的強力性能。

表2 不同納米纖維膜的力學性能Tab.2 Mechanical properties of different nanofibrous membranes

2.3 親疏水性分析

圖2示出改性前后納米纖維膜表面的水接觸角。可知，PLGA納米纖維膜表面在未改性未載藥前的水接觸角為93.5°，顯示出PLGA材料的疏水性；PLGA/Col(51.5°)和PLGA/DOX(54°)復合納米纖維膜表面的水接觸角在改性和載藥后均降至50°左右，充分證實膠原蛋白或DOX的載入能夠使PLGA納米纖維膜表面呈現出較大程度的親水性。水接觸角降低最為明顯的是PLGA/Col/DOX復合載藥納米纖維膜，其表面水接觸角降至0°。該結果進一步說明，膠原蛋白和DOX的協同作用能夠極大地促進強疏水性PLGA材料表面親水性的顯著改善，實現了PLGA材料疏水性向親水性的轉變。究其原因，與改性材料膠原蛋白分子上的強極性基團有關，也與DOX·HCl的分子結構與性質有關。盡管經過酸化的阿霉素水溶性有了大幅提高，但其在水中的溶解度仍然較低。在噴絲過程中伴隨著溶劑的不斷揮發，鹽酸阿霉素小分子物質會發生不同程度地聚集，并附著在納米纖維表面上，能夠大幅增加納米纖維表面微結構的粗糙度，使材料表面的親水性增強，因此，水接觸角減小[17]。隨著納米纖維膜親水性逐漸增大，水分子更易潤濕聚合物并進入其內部，促進PLGA大分子發生水解反應，并有助于提高納米纖維載藥體系的藥物溶出速率。

圖2 不同納米纖維膜的水接觸角Fig.2 Water contact angle images of different nanofibrous membranes

2.4 化學結構分析

圖3 不同材料的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of different materials

2.5 納米纖維膜的降解性能評價

2.5.1 熱穩定性能分析

圖4示出改性前后納米纖維膜的熱重曲線?？芍?種納米纖維膜的熱分解過程均始于250 ℃左右，并持續到400 ℃左右結束。雖然熱降解起始溫度非常接近，但后期的質量損失率、質量損失速率最大值對應的溫度均有明顯不同。PLGA納米纖維膜的質量殘留率僅約為1%，而PLGA/Col與PLGA/Col/DOX復合載藥納米纖維膜的質量殘留率約為10%；PLGA納米纖維膜的熱質量損失速率最大值對應的溫度約為375 ℃，而PLGA/Col與PLGA/Col/DOX復合載藥納米纖維膜均約為350 ℃，相差約為25 ℃。以上分析表明，經過復合改性后的納米纖維膜更易發生熱降解，說明膠原蛋白和藥物小分子的加入能夠加速PLGA的熱降解歷程[19]。

圖4 不同納米纖維膜的熱重曲線Fig.4 Thermogravimetric curves of different nanofiber membranes

2.5.2 體外降解分析

圖5示出膠原蛋白改性前后PLGA納米纖維膜的降解情況。可知，膠原蛋白改性后的納米纖維膜的質量損失率明顯提高。在30 d的降解周期內，未改性PLGA納米纖維膜的質量損失率僅為3.5%，而PLGA/Col復合納米纖維膜的質量損失率增至19%。值得注意的是，2種納米膜材料在降解前3 d均沒有發生明顯的質量損失。隨著時間的延長，PLGA/Col復合納米纖維膜的質量損失率快速增加，而未改性PLGA納米纖維膜的質量損失率仍增加緩慢。該結果一方面與膠原蛋白復合改性使膜材料的親水性提高有關，水分子更易進入納米纖維內部，從而促進PLGA材料的降解。另一方面與PLGA本身的降解規律有關?，F有研究表明PLGA材料的降解過程主要分為3個步驟：無規鏈段降解，此時分子質量下降較快，但無明顯的質量損失；分子質量下降幅度減小，質量損失增加；形成大量溶于降解環境的低聚物并發生降解，質量損失增加明顯[20-22]。這與本文實驗結果一致，越到后期質量損失速率越快，且膠原的加入加速了降解歷程。

圖5 PLGA、PLGA/Col納米纖維膜降解30 d后的質量損失率Fig.5 Weight loss rate of PLGA and PLGA/Col nanofiber membranes after 30 d of degradation

2.6 體外釋藥性能分析

圖6示出DOX分別在PLGA納米纖維膜和PLGA/Col復合納米纖維膜中的藥物釋放情況?？梢?，PLGA納米纖維膜和PLGA/Col復合納米纖維膜的藥物釋放周期為120 h，二者的累積釋藥量分別為10與21.5 μg，說明經膠原蛋白復合改性后的納米纖維膜的藥物釋放速率顯著提升。PLGA納米纖維膜在釋放48 h時基本停止釋放，究其原因PLGA是強疏水性材料，水分子較難穿越材料內部孔道進入到纖維內部，導致載藥纖維內部的藥物無法在水分子的作用下擴散到纖維外部，因此，所釋放的藥物主要來自于纖維表面附著的藥物。而PLGA/Col/DOX復合載藥納米纖維膜在釋藥溶液中浸漬20 h后，釋藥速度明顯加快，且48 h后仍在緩慢釋藥。主要原因在于膠原蛋白復合改性可使纖維的親水性提高，水分子可穿越材料內部孔道進入到纖維內部，并將纖維內部的藥物通過水分子的作用擴散到纖維外部。綜上所述，經膠原蛋白復合改性后，PLGA由于親水性的提高，納米纖維載藥體系的釋藥性得到改善，提高了藥物持續釋放作用和藥物利用率。

圖6 PLGA/DOX、PLGA/Col/DOX載藥納米纖維膜的藥物釋放曲線Fig.6 Drug release curve of PLGA/DOX and PLGA/Col/DOX nanofiber membranes

2.7 細胞相容性評價

利用MTT法檢測活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的活力，可間接反映細胞在待測材料上的黏附增殖能力及共培養材料的細胞毒性。圖7示出小鼠成纖維細胞L929分別與PLGA、PLGA/Col、PLGA/Col/DOX復合載藥納米纖維膜共培養1、3、5 d后的細胞增殖情況?？芍?，隨著培養時間的延長，與3種納米纖維膜共培養的細胞均顯示出增殖趨勢。其中，PLGA膜材料的細胞黏附增殖情況最差；膠原蛋白改性的PLGA/Col復合膜材料顯示出最優的細胞黏附增殖性能，也說明材料對細胞毒性影響最低，細胞的活性最高；PLGA/Col/DOX復合載藥納米纖維膜材料顯示出來的黏附增殖性能略低于PLGA/Col，與阿霉素抗腫瘤藥物會對正常細胞產生一定毒性有關。該結果表明膠原蛋白復合改性通過改善PLGA的親水性、電荷性等表界面性質，能夠大幅提升PLGA材料的生物相容性，有利于細胞黏附增殖[3-4]。

圖7 L929細胞在不同納米纖維膜上的黏附增殖能力Fig.7 Adhesion and proliferation of L929 cells on different nanofiber membranes

3 結 論

基于生物醫用材料應具備一定的親疏水性、可控降解性及細胞相容性等性質，本文采用膠原蛋白對聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)進行復合改性以實現材料結構的重組和性能的改善，得到以下主要結論。

1)采用膠原蛋白對PLGA材料進行復合改性能夠顯著提高PLGA納米膜表面的親水性。PLGA與膠原蛋白(Col)以3:1的質量比進行復合后，制備得到復合納米纖維膜的水接觸角由93.5°降至51.5°。

2)采用膠原蛋白對PLGA材料進行復合改性能夠改善PLGA降解速率過慢的缺陷，膠原蛋白改性前后納米纖維膜30 d的質量損失速率分別為3.5%和19%，且改性后的載藥體系的釋藥速率大幅提高。

3)采用膠原蛋白對PLGA材料進行復合改性能夠提高PLGA材料的細胞相容性，有利于細胞黏附增殖。PLGA/Col/鹽酸阿霉素(DOX)復合載藥納米纖維膜具有作為腫瘤局部治療藥物傳遞體系的應用潛力。研究策略可為生物材料及其表界面構建方法提供新的思路。