基于GelMA的3D生物打印技術研究進展及應用

夏培斌，余劉洋，王超威，閆立論，劉志遠，張 鐳，程 杰，崔景強

（1.河南省醫用高分子材料技術與應用重點實驗室，河南 新鄉 453400；2.河南省駝人醫療科技有限公司，河南 新鄉 453400；3.甘肅省醫療器械檢驗檢測所，甘肅 蘭州 730070）

3D生物打印技術是生物制造、增材制造、組織工程和再生醫學融合的產物。利用計算機輔助設計軟件（CAD），將含活細胞的生物材料（生物墨水）連續堆疊和組裝，從而設計出一個有活性的三維結構。該技術旨在人工開發活體組織和器官的替代品，用于組織工程、再生醫學、藥代動力學和生物學研究[1]。

一種理想的生物墨水應該具有目標組織的適當的機械、流變和生物特性，這對確保生物打印組織和器官的正確功能至關重要。GelMA由于其具有的可調節機械性能、良好的生物相容性、原位光聚合能力以及可打印性，越來越被人們認為是一種重要的生物墨水材料[2]。GelMA合成最早是由BULCKE等報道的，GelMA是一種基于明膠的工程材料，已被證明可用于組織工程、藥物輸送、細胞培養和3D打印等領域[3]。

近幾年，基于GelMA水凝膠的生物墨水在3D生物打印技術中被大量研究，這些研究主要集中于生物醫學領域，本文總結了3D生物打印技術的原理、GelMA的合成和表征以及GelMA在3D生物打印技術中的研究進展及應用，以期為基于GelMA的3D生物打印技術的應用提供參考。

1 3 D生物打印技術

組織工程的成功主要依賴于構建復雜、充滿細胞的3D結構能力，這些結構與原始的活組織非常相似。因此，設計和創建生物材料支架的結構和地形的策略是功能性組織工程的一個重要方面。根據工作原理，3D生物打印技術可分為3種，即噴墨生物打印、激光輔助生物打印、擠壓生物打印。這些生物打印策略可以單獨使用或聯合使用，以實現預期的目標和組織制造。

1.1 噴墨打印

噴墨生物打印與傳統的2D噴墨打印非常相似。將生物墨水儲存在墨盒中，然后將該墨盒連接到打印機頭，并在電子控制的打印過程中充當生物墨水源。在打印過程中，通過熱致動器或壓電致動器使打印頭變形并擠壓產生可控制大小的液滴，如圖1（a）所示。噴墨打印的優勢為構造簡單、成本低、打印速度快、有較高細胞生存能力（通常從80%到90%）。缺點也相當明顯，如高黏度的材料或高密度的細胞會導致噴頭堵塞。

1.2 激光輔助打印

這種生物打印策略源于激光誘導正向轉移（LIFT）效應，以精確和微米分辨率打印不同的活細胞和生物材料。激光輔助打印系統的關鍵部分是響應激光刺激的供體層。該供體層為緞帶結構，頂部為吸能層（如鈦或金），底部為懸浮生物墨水溶液層。在印刷過程中，聚焦的激光脈沖用于刺激吸收層的一小片區域。激光脈沖使部分供體層汽化，在生物墨水層的界面產生高壓氣泡，推動懸浮生物墨水[4]。下落的生物液滴被收集到接收底物上，然后交聯，如圖1（b）所示。與噴墨打印相比，激光輔助打印可以避免分配器與生物墨水之間的直接接觸。這種非接觸式打印方法不會對細胞造成機械壓力，因此細胞存活率高通常高于95%。此外，激光輔助打印可以打印高黏性材料。缺點是成本較高，同時由于激光源的存在通常使這類打印機比較笨重和復雜。

1.3 擠壓打印

擠壓打印是噴墨印刷的一種改進。為了打印噴墨打印機無法沉積的黏性材料，擠出打印使用空氣泵或機械螺桿柱塞來分配生物墨水，如圖1（c）所示。通過施加一個連續的力，擠壓印刷可以打印不間斷的圓柱線，而不是單一的生物墨水滴。幾乎所有類型的不同黏度的水凝膠預聚合物溶液以及細胞密度高的聚集物都可以用擠壓生物打印機打印。

圖1 3D生物打印技術原理圖[4]

2 GelMA的合成

制備GelMA的方法，都是基于BULCKE等首次報道的一般方法的微小變化。合成方法如下[5]：將明膠加入至PBS中，50℃攪拌至完全溶解，然后以一定的速率加入MA，反應3 h。混合溶液用PBS稀釋以停止反應，通過透析5～7 d，完全去除具有潛在細胞毒性的低分子量雜質。最后，將透析液冷凍干燥后冷藏待用。

3 GelMA生物墨水表征

生物墨水在生物打印中扮演著重要的角色。它們不僅與細胞直接接觸以提供結構支持，而且還支配著生物墨水的化學和物理特性。理想情況下，用于生物打印的水凝膠應該具有如下特性。

3.1 可打印性和可交聯性

可打印性指生物墨水和基質之間的關系，可以打印出準確、高質量的結構。在生物打印中，可打印性通常與表面張力有關。生物墨水經加壓后，只有快速交聯才能保證打印結構的保真性。

3.2 機械性能

水凝膠應在聚合后保持足夠的機械性能，為細胞提供穩定的附著、增殖和分化環境[6]。這些力學性能包括應變、剪切應力、壓縮模量和質量膨脹比。

3.3 生物相容性

生物相容性指材料在特定情況下與宿主發生適當反應的能力。生物相容性要求材料本身對細胞增殖無害，并具有提供與細胞適當結合的能力。同時要求材料可以被細胞降解或與細胞融合，而不會產生有害的副產品或與細胞產生負面的相互作用。

3.4 降解性

不受控制的快速降解是GelMA在生物醫學領域面臨的主要挑戰，組織支架的基本職責是在整個結構的預期使用壽命內保持細胞增殖和所需的細胞分布。因此在設計生物墨水時，一個重要的考慮因素是支架在生物降解和愈合過程中的功能依賴性在支架和新生組織之間的轉變。

4 3D生物打印技術應用

本部分從幾種常見的組織類型等方面綜述了3D生物打印技術的應用現狀。

4.1 血管

傳統的微加工技術無法創建復雜的多尺度結構，如血管內皮與周圍結締組織和薄壁細胞之間的界面，3D生物打印技術可能解決這個問題。例如TURNER等[7]設計了一種定制的細胞響應型生物墨水，該墨水由GelMA外殼包裹著肽功能化的細胞負載的琥珀酰殼聚糖/葡聚糖醛核心，成功地進行了生物打印，結果產生了有組織的微設計，顯示出出色的細胞活力及隨后血管形成。XU等[8]在GelMA中添加透明質酸、甘油和明膠，形成具有良好打印性、機械強度和生物相容性的生物墨水，利用三維微擠壓生物打印機在固體平臺上一步制備出一種小直徑、異質雙分子層血管樣結構，與天然血管高度相似，保持了較高的細胞存活率和增殖能力。

4.2 軟骨

迄今為止，關節軟骨損傷的治療仍然具有挑戰性。混合生物打印結合了發育生物學、生物材料科學和3D生物打印的原理，是發展新的再生療法的一個有前途的策略。在這種方法中，使用小直徑的無支架軟骨微組織作為構建塊，與光交聯水凝膠結合，然后進行生物打印。ZHOU等[9]利用GelMA和聚二丙烯酸酯打印3層梯度支架，涂上賴氨酸功能化玫瑰形納米管，以改善脂肪來源間充質干細胞的軟骨分化。結果表明可以促進間充質干細胞增值分化，軟骨形成良好。MU等[10]從人體脂肪組織分離脂肪干細胞（hADSCs），取第3代細胞與GelMA水凝膠和光引發劑混勻制成生物墨水，然后采用3D生物打印技術制備出hADSCs-GelMA復合支架。對其進行培養檢測，結果表明復合支架具備穩定的三維結構，細胞存活率高，可在體內、外誘導分化為軟骨組織，可用于體內外構建組織工程軟骨。以上研究為應用3D生物打印技術構建組織工程軟骨提供了一定的思路和研究基礎。

4.3 皮膚

現在，利用3D生物打印技術可以模擬和制造出人體最大、最復雜的多層器官，即皮膚。3D打印皮膚具有巨大的潛力，可用于傷口愈合、燒傷皮膚置換以及用于產品和藥物測試的體外人體皮膚模型。ZHOU等[11]研究利用基于GelMA的仿生生物墨水結合數字光處理的3D打印技術，成功打印出一種功能活性皮膚，具有相互連接的微通道，促進細胞遷移、增殖和新組織的形成。體內研究表明，活體皮膚具有即時防御功能，在促進大型動物皮膚附肢真皮再生方面具有優越的表現。JIN等[12]利用脫細胞真皮基質和GelMA生物墨水，成功打印出一種功能皮膚模型（FSM）。研究表明FSM不僅能促進細胞增殖和存活，還能支持體外表皮重建。在體內移植后，FSM可維持細胞活力至少1周。此外，FSM促進創面愈合和上皮再生，刺激真皮ECM分泌和血管生成，提高創面愈合質量。

5 結語

生物打印技術是一種先進的基于生物墨水負載細胞的技術，具有廣闊的發展前景，同時也面臨許多挑戰和問題。由于生物打印在微尺度、高通量、細胞沉積等方面的優勢，其應用正在迅速擴大。基于GelMA的3D生物打印技術已成為一種強大的制造工具，以創建復雜的微觀和宏觀尺度生物醫學系統。即使已經取得了這些進展，生物打印仍然是一項具有驚人潛力的新興技術。