多重雜質(zhì)吸附結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定寵物飼料中牛磺酸

索德成， 肖志明， 王 石， 王繼彤， 姚 婷， 劉曉露， 范 理， 樊 霞*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準與檢測技術(shù)研究所，北京 100081；2.北京市獸藥飼料監(jiān)測中心，北京 100101）

牛磺酸（Taurine）又稱β-氨基乙磺酸，是一種含硫的非蛋白氨基酸，作為機體的條件必需氨基酸，多以游離態(tài)廣泛存在于動物體內(nèi)各組織器官，并以小分子二肽或三肽的形式存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有多種生理活性和營養(yǎng)作用（李衛(wèi)娟等，2006；劉惠芳等，2003）。牛磺酸雖然不直接參與機體蛋白質(zhì)合成，但其可通過影響胱氨酸和半胱氨酸的代謝從而參與新陳代謝（何曉芳等，2022）。人和一些動物機體可以從膳食中攝取或經(jīng)自身合成牛磺酸，但對于犬貓等動物特別是貓科動物來說，體內(nèi)不能合成牛磺酸，只能依靠從外界攝取（李衛(wèi)娟等，2006；黃天珍，1994）。如果貓沒有獲得足夠的牛磺酸，會出現(xiàn)如視網(wǎng)膜退化、視力衰退、擴張型心肌癥消化疾病、生殖功能衰竭、免疫功能失調(diào)、發(fā)展遲緩等健康病癥（吳興利等，2006；趙建偉等，1999；黃天珍，1994）。因此，寵物飼料生產(chǎn)過程中會額外加入牛磺酸以保證動物機體的健康生長，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第20號中的《寵物飼料標(biāo)簽規(guī)定》也將牛磺酸作為產(chǎn)品標(biāo)簽中成分分析保證值的強制性標(biāo)示參數(shù)。

目前寵物飼料中牛磺酸的檢測分析與食用動物飼料采用的方法一致，主要包括比色法（李詠梅等，2013；楊涓等，2005）、高效液相色譜法（殷秋妙等，2016；楊曦等，2014、2013；張曉鳳等，2012）、氨基酸分析儀測定法（王洪健等，2012）等，其中高效液相色譜法是最常用的檢測方法，但其檢測過程需要使用丹磺酰氯、鄰苯二甲醛、二硝基氟苯等進行衍生，操作復(fù)雜；此外，寵物飼料成分復(fù)雜，動物源性原料如肉類、動物油脂類含量高，與傳統(tǒng)食用動物飼料基質(zhì)存在較大差別，提取后雜質(zhì)干擾大，影響衍生效率和色譜定量，檢測重復(fù)性差，無法滿足寵物飼料中牛磺酸的準確定量要求。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）靈敏度高，選擇性和特異性好，近年來已被廣泛應(yīng)用于氨基酸類化合物檢測（陳曉峰等，2015；鄧其馨等，2014；李鵬飛等，2013、2012）。配合多重雜質(zhì)吸附技術(shù)可在前處理過程中凈化寵物飼料基質(zhì)中的雜質(zhì)干擾。本實驗旨在建立多重雜質(zhì)吸附結(jié)合LC-MS/MS定性定量分析寵物飼料中牛磺酸的方法，為復(fù)雜的寵物飼料基質(zhì)中牛磺酸的檢測分析提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1實驗材料 寵物飼料樣品由國家飼料質(zhì)量檢驗檢測中心（北京）提供，固體樣品全部粉碎過0.45 mm孔徑篩，所有樣品全部混合均勻。

鹽酸（分析純，北京化工廠）；甲酸、乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher ChenAlert Guide公司）；牛磺酸對照品（純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司）；實驗用水為Milli-Q純化后的一級水（＞18.2 MΩ）。

前處理吸附材料：Cleanert S C18（粒徑50 μm）、Cleanert S中性氧化鋁（Alumina-N，粒徑150 μm）、Cleanert S活性碳（PestiCarb，粒徑120~400 mesh）、Cleanert S Nano Carb（粒徑10~20 nm），均購置于Agela Technologies公司；BONDESILSAX（粒徑40 μm）、BONDESIL-SCX（粒徑40 μm）、BONDESIL-PSA（粒 徑40 μm）、BONDESIL-FL（粒徑200 μm，均購置于美國Agilent Technologies公司）。

1.2儀器和設(shè)備Acquity超高效液相色譜：配備TQS三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；MS2漩 渦 混 合 器 （德 國IKA公 司）；Centrifuge 5810離心機（德國Ependorf公司）。

1.3實驗方法

1.3.1 樣品稀釋溶液 移取0.1 mL甲酸和10 mL乙腈，加水定容至100 mL。

1.3.2 標(biāo)準溶液配制 準確稱取牛磺酸對照品，置于棕色容量瓶中，用水配成濃度約為100 mg/mL的標(biāo)準貯備液；再準確吸取牛磺酸貯備液，用樣品稀釋溶液稀釋成濃度為0.01~10 μg/mL的標(biāo)準工作液。

1.3.3 多重吸附前處理吸附材料的配制 稱取10 g C18吸附材料，15 g中性氧化鋁吸附材料，10 g活性碳吸附材料于50 mL三角瓶中，混合均勻。

1.3.4 樣品前處理 準確稱取2.0 g（精確至0.001 g）樣品，置于50 mL離心管中，準確加入20 mL 0.5 mol/L鹽酸溶液，超聲提取30 min，然后于8000 r/min離心2 min，取2 mL上清液置于5 mL離心管中，加入50 mg多重吸附前處理吸附材料，漩渦混合30 s，于8000 r/min離心2 min。將1 mL上清液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入9 mL水，漩渦混合30 s，過0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS分析測定。若樣品中含量超出線性范圍，應(yīng)用樣品稀釋液稀釋至線性范圍后再進行上機分析。

1.4色譜質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（150 mm×3.0 mm×1.7 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：5 μL；流動相及參考梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相及梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采用電子噴霧離子源，正離子檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測（HRM）模式；噴霧電壓為3.0 Kv；霧化氣溫度為480℃；源溫度為150℃；霧化氣流速為600 L/hr；錐孔氣流速為5 L/hr；脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮氣及其他合適氣體，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求。

2 結(jié)果與分析

2.1流動相的優(yōu)化 參考鄧其馨等（2014）、李鵬飛（2013）和標(biāo)準方法（GB 5009.169-2016和農(nóng)業(yè)部2483號公告-5-2016），分別選擇乙腈和甲醇作為流動相進行實驗。結(jié)果表明，當(dāng)使用甲醇作為流動相的時候，在相同的條件下，離子化將受到不同程度的抑制，響應(yīng)值將會明顯的降低，導(dǎo)致靈敏度的下降；而使用乙腈作為流動相時，離子化效率明顯優(yōu)于使用甲醇作為流動相的情況，所以本實驗采用乙腈為流動相。使用優(yōu)化流動相的典型色譜圖見圖1。

圖1 牛磺酸標(biāo)準溶液（10 μg/mL）色譜質(zhì)譜圖

2.2監(jiān)測離子對的選擇 監(jiān)測離子對是串聯(lián)質(zhì)譜儀定性、定量的必要參數(shù)，因儀器型號不同而略有改變。以牛磺酸的標(biāo)準溶液在ESI源正離子模式下掃描，選出信號相對較強的兩個碎片離子與其母離子分別組成兩對監(jiān)測離子對，在UPLC-MS/MS儀器的MRM模式下，實施對于錐孔電壓與碰撞能量等參數(shù)的進一步優(yōu)化，優(yōu)化過后得到的MRM離子對和質(zhì)譜條件見表2。

表2 牛磺酸質(zhì)譜參考值

2.3樣品前處理方法的確定

2.3.1 提取液及提取方式的選擇 由于牛磺酸是水溶性物質(zhì)，一般采用水溶液提取，但由于寵物飼料中蛋白質(zhì)、脂肪類物質(zhì)含量較高，簡單用水提取后，不能將牛磺酸和蛋白質(zhì)、脂肪類物質(zhì)有效分離，會影響檢測結(jié)果，故需要對前處理提取溶劑進行篩選。蔡梅等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，采用酸水解后將樣品基質(zhì)中的蛋白質(zhì)和脂肪等轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄晕镔|(zhì)，可以提高回收率，但是過高的酸會影響檢測結(jié)果。因此，本實驗比較了0.2~6 mol/L HCl溶液的提取效果，根據(jù)實驗結(jié)果，最終選擇0.5 mol/L HCl作為提取液對樣品進行提取，回收率和相對標(biāo)準偏差均能滿足方法學(xué)需要。確定了提取溶劑后，比較振蕩提取和超聲波提取對牛磺酸提取效率的影響，對結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，2種提取方法無明顯差異。但為了節(jié)約時間，最終選用超聲處理。脂肪量低樣品或液體樣品中牛磺酸的測定可用水提取或直接加水稀釋后測定。

2.3.2 凈化吸附材料的選擇 本實驗選擇8種吸附材料（表3）對寵物飼料中的牛磺酸進行吸附實驗。稱取寵物飼料樣品25 g，加入100 mL提取液，離心，轉(zhuǎn)移至試劑瓶中。分別吸取3 mL提取液，加入0.3 mL 1 μg/mL牛磺酸標(biāo)準溶液和50 mg吸附材料（材料比例），漩渦混合30 s，在搖床上振蕩10 min，離心5 min，取上清液過膜，上機檢測。同時吸取3 mL提取液，不加入吸附材料作為空白參考。用樣品溶液測定值與空白參考測定值的百分比值作為吸附率，吸附結(jié)果見圖2。

表3 吸附材料名稱與類型

圖2 不同吸附材料對寵物飼料中牛磺酸的保留率

結(jié)果表明，除了C18、Alumina和石墨碳外，其他大部分吸附材料對牛磺酸有一定的富集，但是其對牛磺酸吸附率均低于100%，無法作為富集材料使用。多重機制雜質(zhì)吸附（MIA）是一種基于基質(zhì)分散固相萃取的方法，該方法主要通過選擇多種功能化吸附材料，將樣品中的主要干擾雜質(zhì)吸附，有效地去除基體中可能存在的磷脂、色素等物質(zhì)，同時將被測物質(zhì)留在樣品溶液中，而達到凈化和富集的目的，可節(jié)省樣品前處理的時間（Suo，2021）。因此，選擇C18、Alumina和石墨碳作為多重機制雜質(zhì)吸附材料進行下一步的研究。

2.3.3 前處理材料的比例和使用量的研究 根據(jù)不同材料的吸附特性，如石墨碳主要是物理性吸附，主要吸附氣體、色素類物質(zhì)；C18吸附填料主要吸附磷脂和中等極性的化合物；中性氧化鋁是物理性吸附，主要去除油脂類的類物質(zhì)。通過混合使用可以有效的去除寵物飼料的各種雜質(zhì)干擾，達到更好的凈化效果。從基質(zhì)凈化效果來看，石墨碳、C18和中性氧化鋁的比例為2∶2∶3，能有效地吸附雜質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)。

本研究同時考察了吸附材料的使用量，比較了5、10、20、50、80、100 mg不同固體吸附劑加入量對2 mL飼料提取液中雜質(zhì)凈化效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)固體吸附材料加入量達50 mg時，繼續(xù)加大吸附劑的用量對樣品雜質(zhì)的凈化效果和回收率無明顯改善。因此將吸附材料加入量設(shè)定為50 mg。當(dāng)加入吸附劑吸附凈化后，可以有效地除去基質(zhì)中的干擾物對待測物色譜峰的影響，同時減少雜質(zhì)對儀器和色譜柱的損害。

2.4線性、檢出限和定量限 根據(jù)1.4.2配制標(biāo)準溶液并上機測定，根據(jù)3倍信噪比確定檢出限（LOD）、10倍信噪比確定定量限（LOQ），牛磺酸的標(biāo)準曲線、檢出限和定量限見表4。

表4 牛磺酸的標(biāo)準曲線、檢出限和定量限

2.5回收率和精密度 在確定樣品前處理方法后，選擇有代表性的6種空白寵物飼料樣品作為研究對象，進行加標(biāo)回收實驗，以考察方法的準確度和重現(xiàn)性。配制10、100 mg/kg和500 mg/kg三個濃度的試樣，每批次內(nèi)同一濃度做6次平行實驗，共重復(fù)3批次，實驗結(jié)果見表5。

表5 不同寵物飼料添加回收結(jié)果 %

從表5中可以看出，建立的檢測方法回收率＞85%，相對標(biāo)準偏差＜10%，該方法可適用于不同種類寵物飼料中牛磺酸含量的測定。

2.6實際樣品分析 基于以上條件建立的檢測方法，對從市場上采集到的20份不同的寵物飼料樣品進行檢測，檢測結(jié)果見表6。大部分牛磺酸的測定結(jié)果比標(biāo)示值高，其原因可能是企業(yè)考慮到牛磺酸添加后的不穩(wěn)定因素，為了保證終產(chǎn)品中牛磺酸滿足標(biāo)識量要求，一般在設(shè)計配方和實際生產(chǎn)時會適當(dāng)超出一定量添加牛磺酸，導(dǎo)致樣品的檢測結(jié)果高于產(chǎn)品標(biāo)示值。

表6 典型寵物飼料中牛磺酸檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本研究中通過對前處理條件及儀器條件參數(shù)進行優(yōu)化，建立了多重機制雜質(zhì)吸附萃取凈化結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定寵物飼料中牛磺酸的方法，該方法可滿足寵物飼料中牛磺酸的分析要求，且操作簡便、分析效率高，可用于相關(guān)樣品的日常檢測及監(jiān)控分析。