基于TCGA數據庫膠質母細胞瘤患者預后鐵死亡基因相關lncRNA預測模型構建

裴珍珍，王革生，宋光榮，蔡旭，杜勇，東瀟博

北京中醫藥大學東方醫院神經外科，北京 100078

膠質瘤是顱內高發的惡性腫瘤，發病率約占所有惡性腦腫瘤的81%。而膠質母細胞瘤（GBM）是最常見的膠質瘤組織學類型，約占所有膠質瘤的45%，其惡性程度和病死率極高，臨床治療效果差，5年存活率僅為5%［1］。鐵死亡是由DIXON等［2］提出的一種非凋亡、鐵依賴性、氧化性細胞死亡機制，與傳統的細胞凋亡和壞死不同，是鐵依賴性脂質過氧化物積累的結果。鐵死亡在調節諸如淋巴細胞瘤、胰腺導管細胞癌、腎細胞癌和肝細胞癌等某些類型腫瘤細胞的生長和增殖方面起著重要作用。研究表明，鐵死亡可以殺死腫瘤細胞，抑制腫瘤生長［3］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一種被定義為超過200個核苷酸、缺乏蛋白質編碼功能的轉錄本。lncRNA具有細胞和組織特異性表達的特點，在癌癥中差異表達，并顯示出與臨床結果的明顯相關性。近年來，隨著對鐵死亡與腫瘤新療法的不斷研究，新的lncRNA功能不斷被揭示。然而，鐵死亡相關的lncRNA在GBM中的作用和預后評估中的價值仍不清楚。TCGA是美國國立衛生研究院（NIH）啟動的一項公共資助項目，旨在利用創新的基因組測序分析技術加速對癌癥遺傳學的全面了解，幫助產生新的癌癥診斷、治療方法和預防策略［4-5］。而GBM是腫瘤基因組圖譜（TCGA）預實驗研究的第一種癌癥，諸多鐵死亡相關的lncRNA在GBM的作用和預后評估中的價值未知。2021年7月－8月，我們以TCGA數據庫中GBM的高通量測序數據為基礎，借助R語言對基因組數據進行綜合分析，探索GBM中鐵死亡基因與lncRNA的共表達關系，篩選與GBM預后相關的鐵死亡相關lncRNA，為改善GBM患者預后、尋找新的治療方法提供參考。

1 資料與方法

1.1 數據來源選取TCGA數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中具備完整隨訪資料的GBM樣本，并下載GBM腫瘤組織和癌旁組織的高通量測序數據及臨床資料。利用Perl對下載的轉錄組數據和臨床資料分別進行轉換和信息提取，以用于后續分析。數據下載截至2021年8月16日。通過文獻檢索和Ferrdb數據庫（http：//www.zhounan.org/ferrdb）兩種方式獲取與鐵死亡相關的全部基因集。

1.2 GBM中鐵死亡差異表達基因的篩選通過R語言的“limma”包對TCGA隊列中的腫瘤組織和癌旁組織做基因的差異表達分析，以|logFC|＞1和FDR＜0.05為標準進行過濾，篩選出與鐵死亡顯著相關的差異基因。

1.3 GBM中鐵死亡lncRNA的獲得及其與鐵死亡基因的共表達分析運行“limma”包計算鐵死亡基因和lncRNA之間表達的相關性，確定鐵死亡相關的lncRNA。P＜0.001，兩者之間存在共表達關系；cor（相關系數）＞0，兩者為正調控關系，cor＜0，兩者為負調控關系。借助Cytoscape軟件（version：3.8.2）構建鐵死亡基因與鐵死亡lncRNA共表達關系的網絡圖。

1.4 富集分析利用R語言的“clusterprofiler”包對篩選出的差異有統計學意義的鐵死亡基因進行基因本體論（GO）和京都基因百科全書（KEGG）分析；在線作圖軟件ImageGP繪制氣泡圖。GSEA軟件（Version：4.1.0）進行基因集（GSEA）富集分析，研究高危組和低危組之間生物學功能的差異，定義富集分數（ES）＞0的通路或功能在高風險組是活躍的，ES＜0的通路在低風險組是活躍的。其中，錯誤發現率（FDR）＜0.05被認為是顯著富集的功能或通路。

1.5 GBM預后模型的建立使用“survival”包對594例GBM患者鐵死亡相關lncRNA表達矩陣進行單因素Cox回歸分析，評估每個lncRNA的預后價值，篩選出與GBM生存期相關的鐵死亡lncRNA（P＜0.01），為避免過度擬合帶來的干擾，采用LASSO Cox回歸降維方式過濾部分線性相關的特征，確定與GBM預后顯著相關的鐵死亡lncRNA，建立多基因預后風險模型。根據lncRNA表達量和相應系數計算每個GBM患者的風險評分。以風險評分的中位數為截斷值，將患者分為高風險組和低風險組。運用R語言的“survminer”包和Kaplan-Meier生存分析對高、低風險組進行評價并繪制Kaplan-Meier生存曲線，評估高、低風險組樣本總體生存率的差異情況。P＜0.05為差異有統計學意義。

1.6 統計學方法基于R（Version：4.0.2）進行數據統計分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GBM中鐵死亡相關基因表達差異分析通過文獻檢索和Ferrdb數據庫下載共獲得鐵死亡基因382個，其中246個鐵死亡基因在GBM表達。對該部分基因進行差異分析，篩選出差異有統計學意義的鐵死亡基因102個，其中，67個基因在腫瘤組上調，35個下調；對其進行GO和KEGG富集分析，篩選差異表達基因的生物學功能。差異基因顯著富集在細胞對化學應激、氧化應激的反應、對營養水平、細胞外刺激等生物學過程；細胞組成部分包括黏著斑、細胞-基底連接、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物等是差異基因富集最顯著的，分子功能富集結果主要集中在泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合、鐵離子結合等。KEGG通路分析主要集中在癌癥中微小RNAs、自噬、鐵死亡、內分泌抵抗等。GSEA富集分析顯示，高危組富集較顯著的通路包括細胞因子受體相互作用通路、溶酶體、谷胱甘肽代謝通路、半乳糖代謝通路、糖胺聚糖降解通路、氨基糖和核苷酸糖代謝通路等，低風險組未發現具有統計學意義的功能或通路。

2.2 GBM預后相關的鐵死亡lncRNA及其與鐵死亡差異基因的共表達分析GBM中與鐵死亡相關的lncRNA 2 624個，通過單因素Cox分析共篩選出111個影響GBM預后的鐵死亡lncRNA，風險比（HR）＞1代表該lncRNA是影響預后的高危因素，反之為保護因素；69個差異有統計學意義的鐵死亡基因與73個GBM預后相關的鐵死亡lncRNA之間存在共表達關系，這73個lncRNA包含高、低風險，69個差異鐵死亡基因中，22個在GBM中下調，47個上調，表明在GBM中，鐵死亡基因與lncRNA之間具有復雜的調控關系，鐵死亡基因與鐵死亡lncRNA的共表達關系如圖1所示，中度值較高的鐵死亡基因與lncRNA見表1～2。

表1 共表達關系中度值≥8的鐵死亡基因

2.3 臨床預后模型的建立與驗證以風險得分的中位數為截斷值，GBM患者分為高風險組79例和低風險組80例。Kaplan-Meier曲線分析顯示，高風險lncRNA特征的表達與較差的存活率相對應（P＜0.001），低風險組生存時間大于高危組。

3 討論

GBM是世界衛生組織Ⅳ級膠質瘤，其高度浸潤性、遺傳異質性以及血腦屏障（BBB）的保護為GBM的治療帶來了挑戰。GBM標準治療方法是手術切除，然后進行放化療。然而，GBM細胞強大的DNA修復和自我更新能力，使GBM表現出對現有治療方法的不敏感性。在過去20年里，GBM患者生存期僅提高了10個月左右，腫瘤術后復發率更接近100%［6-7］。美國的5年生存率僅達到7.2%［8］。改善GBM患者的生存預后、提高其生命質量成為人類孜孜探索但迄今尚未攻克的難題。癌細胞的高鐵水平及其對鐵死亡誘導的敏感性增加，使得鐵死亡成為腫瘤研究的熱點［9］。同時，高通量基因組學數據的發展為GBM患者帶來新希望，對GBM耐藥機制和腫瘤異質性的認識，對基因突變特征和規律的探索，對有效治療靶點的篩選和藥物研發，將是開發有效治療方法的關鍵，未來可能使GBM的總體治療效果獲得里程碑式突破。

表2 共表達關系中度值≥8的lncRNA

因此，本研究從GBM轉錄組數據著手，以鐵死亡基因為載體，探索GBM中鐵死亡基因與lncRNA的關系，獲取影響GBM預后的關鍵鐵死亡lncRNA。最終獲得了104個鐵死亡基因和2 624個鐵死亡相關的lncRNA，通過Cox分析確定了111個影響GBM預后的鐵死亡lncRNA，69個具有統計學差異的鐵死亡基因與73個GBM預后相關的lncRNA之間相互存在共表達關系；其中，AC004847.1、AC023043.3、LINC01127、LINC01574、LINC01943等是影響GBM預后的風險較高的lncRNA，鐵死亡基因SAT1、WIPI1、TNFAIP3、NCF2、ALOX5、FTL、NGB、ACSL4、GOT1、MAPK8、SLC2A12等與這些lncRNA在共表達關系中度值最高，調控關系較為復雜。

SAT1是本研究中與lncRNA共表達關系最復雜的鐵死亡基因之一，在GBM中表達上調。一項針對677個GBM患者腫瘤中SAT1評估，發現與低級別膠質瘤相比，SAT1在高級別GBM中顯著過表達［10］。在針對GBM治療的研究中，Brett-Morris A證明抑制SAT1，可增加多形性GBM對放射的敏感性［11］。此后，該團隊通過過表達SAT1，再此印證了該結論［12］。這一發現與本研究結論相同：表達上調的SAT1與GBM的發生相關，提示SAT1可能是治療GBM的敏感靶點，啟示科研人員可借助基因治療甚至是藥物治療等方法去改變SAT1水平，增強GBM輻射反應。

ACSL4、GOT1、MAPK8、SLC2A12等基因在GBM中表達下調。長鏈酯酰輔酶A合成酶4（ACSL4）可參與磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇等易氧化膜磷脂的合成，促進多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化，從而參與鐵死亡發生［13］。在宮頸癌、肺腺癌、三陰性乳腺癌等腫瘤中，高表達ACSL4均表現出對腫瘤細胞的增殖抑制［14-16］。本研究中，ACSL4在GBM中低表達，提示或許可通過高表達鐵死亡基因ACSL4，達到抑制GBM發展的效果，這可能是GBM治療的一個有意義的著手點。而同屬GBM中低表達基因GOT1，在肝癌、胰腺癌等消化系統腫瘤的研究中顯示相反的效果：沉默GOT1可抑制肝癌細胞的存活，減小裸鼠移植瘤的體積［17］。抑制GOT1表達可通過鐵死亡促進胰腺癌細胞死亡［18］。這一鐵死亡基因應引起研究人員的關注，是否GOT1表達可在不同腫瘤中產生不同的結果，有待進一步研究。

lncRNA是重要的表觀遺傳調控因子，在癌癥發生和惡性進展中發揮關鍵作用。在GBM中，lncRNA的異常表達可能會改變基本的細胞生物學過程，并導致GBM的惡性表型［19-20］。此外，特定lncRNA的差異表達也可能與GBM干細胞（GSC）的致瘤特性相關［21］。本 研 究 發 現，LINC01127、AC004847.1、LINC01574、LINC01943、AC023043.3、AL353796.1、AL133215.2、AC126407.1等lncRNA是影響GBM預后關鍵lncRNA，且與鐵死亡基因之間存在密切調控關系。其中，LINC01127、AC004847.1、LINC01574、LINC01943、AC023043.3等lncRNA是影響GBM的高危基因，而AL353796.1、AL133215.2、AC126407.1是GBM的保護基因。而諸如AC004847.1、LINC01574、AC023043.3、AL353796.1、AL133215.2等諸多lncRNA尚未被研究；在GBM中，相關研究更少，甚至從未被研究，提示這些鐵死亡基因與lncRNA可能成為GBM研究的著手點，亟需更多關注。

本研究借助TCGA的高通量測序數據，鑒定了111個與鐵死亡相關的lncRNA。這是第一項針對GBM構建的鐵死亡相關的lncRNA預后的研究，為臨床醫生和科研人員開發了一種有效、實用的方法，可用于預測GBM患者的生存期并制定個性化治療方案。然而，本研究仍存在局限性，文中所涉及的高通量測序數據僅來自TCGA數據庫，且對預后模型有效性的驗證方法相對單一；檢測已鑒定的鐵死亡相關lncRNA在細胞系和臨床樣本中表達水平的相關基礎實驗很少，部分鐵死亡lncRNA是之前未研究過的，其功能和機制有待進一步體外和體內研究，以期提供其作為治療GBM新候選靶點的潛力。