TNF-α對腸屏障功能的影響及機制

阿曼古麗·莫明，卡依賽爾·阿布都肉蘇力，雷泓，張琪，宋云林

1新疆醫科大學第一附屬醫院重癥醫學中心，烏魯木齊 830054；2新疆醫科大學第一附屬醫院醫學研究中心

腸屏障主要由單層上皮細胞緊密連接組成的機械屏障、黏液層組成的化學屏障和固有層的免疫屏障構成［1］。其中黏液層作為腸屏障中的第一道天然屏障，可將腸上皮細胞層與腸腔隔開，起到保護上皮細胞免受病原菌或其他毒素等的刺激和攻擊［2］，維持其完整性對于保護腸屏障功能尤其重要。黏蛋白2（MUC2）是黏液層的主要成分，其水平降低會引起黏液層變薄、通透性增加，促進病原菌大量遷移至上皮細胞，進而引起各種腸道疾病［3］。異常水平的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可激活JNK信號通路，形成TNF-α/JNK連接炎癥/應激信號的網絡，從而影響腸屏障功能［4］。然而，TNF-α、JNK信號通路及MUC2之間的相互影響和腸道發病機制的特征尚不明確。2022年3月—7月，我們探討了TNF-α對腸屏障功能的影響及作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料人結直腸腺癌（Caco-2）細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司，TNF-α購自義翹神州科技股份有限公司；PBS、DMEM高唐培養基和CCK8試劑盒均購自白鯊生物科技有限公司；胎牛血清和胰酶購自美國Gibco公司；兔抗MKK4、MEKK1、GAPDH兔抗多克隆抗體和羊抗兔Ⅱ抗均購自武漢三鷹生物技術有限公司；全蛋白提取試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司；RT-PCR試劑盒購自成都福際生物技術有限公司；引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 細胞培養及實驗分組取Caco-2細胞，使用含20%胎牛血清、1%雙抗和DMEM高糖培養基的完全培養基培養，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中，24 h換1次液，待其長滿用0.25%胰酶消化，2∶1傳代培養，待其穩定生長，取對數生長期的細胞開展后續實驗。細胞穩定生長后隨機分為四組，對照組給予完全培養基培養，低劑量組給予TNF-α 100μg/L，中劑量組給予TNF-α 120 μg/L，高劑量組給予TNF-α 140μg/L，培養6 h后，收集細胞、上清及蛋白等。

1.3 細胞形態學改變倒置顯微鏡下觀察Caco-2細胞形態學改變。將細胞用胰酶消化，1 000 r/min離心5 min（離心半徑17.79 cm），棄上清，加1 mL完全培養基重懸細胞，并使用細胞計數板計數，以1×106/孔的密度接種于6孔板內，每組設3個復孔，放入培養箱內培養24 h，使細胞貼壁并進入對數生長期進行干預，6 h后，棄培養基，用PBS洗1次，使用倒置顯微鏡觀察細胞形態學改變。

1.4 細胞活力檢測采用CCK-8法。將穩定生長的Caco-2細胞以1×104/孔的密度接種于96孔板內，每組設5個復孔，放入培養箱內培養24 h，使細胞貼壁并進入對數生長期進行干預，待6 h后，先棄去原有培養基，避光狀態下每孔加入100 μL DMEM基礎培養基＋10 μL CCK-8試劑，再放回細胞培養箱內培養2 h，取出后用酶標儀檢測450 nm波長處光密度（OD）。細胞活力=［OD（加藥）-OD（空白）］/［OD（未加藥）-OD（空白）］×100%，計算每組細胞的細胞活力。

1.5 細胞MUC2 mRNA檢測采用RT-qPCR法。使用RNA提取試劑盒提取各組Caco-2細胞總RNA，將RNA反轉錄為cDNA，再使用實時熒光定量PCR儀進行PCR檢測。PCR反應條件：95℃3 min，95℃10 s、60℃30 s共40個循環，最終數據以2-ΔΔCT進行分析，每個樣本重復3次。引物序列：GAPDH正向引物：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，反向 引物：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。MUC2正向引物：5'-CCTTCCTCTGTGCTTATCTGCTGTG-3'，反向引物：5'-GGTGTCTCCGTATGTGCCGTTG-3'。

1.6 JNK1和MKK4蛋白表達檢測采用Western blotting法。待干預時間到6 h，收集四組細胞并用預冷的PBS洗2次，用胰酶消化并以1 000 r/min離心5 min（離心半徑17.79 cm），再用PBS重懸細胞移至1.5 mL的EP管；根據全蛋白提取試劑盒的操作說明進行貼壁細胞蛋白提取，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，調整各組蛋白濃度至一致并使蛋白變性，上樣進行SDS-PAGE分離；電泳結束后用PVDF膜進行轉膜，洗膜5次/5 min，牛奶封閉2 h，洗膜5次/5 min；隨后加入一抗，JNK1抗體（稀釋比例1∶1 500）、MKK4抗體（稀釋比例1∶1 000）和GAPDH抗體（稀釋比例1∶20 000），4℃冰箱過夜。次日，回收一抗，洗膜5次/5 min，孵育二抗HRP（稀釋比例1∶10 000），洗膜5次/5 min，配制ECL顯色液，進行曝光。

1.7 統計學方法采用Graphpad Prism 8.0.1軟件。計量資料符合正態分布以±s表示，多組數據間的比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度TNF-α對Caco-2細胞形態的影響不同濃度的TNF-α分別干預Caco-2細胞6 h后，倒置顯微鏡觀察可見，對照組細胞形態無明顯變化，排列整齊，細胞間緊密連接清晰可見（圖1A）。不同濃度TNF-α刺激6 h后，細胞形態發生變化，由不均一多邊形逐漸轉變為圓形，排列紊亂且細胞間緊密連接逐漸消失（圖1B-D）。

圖1 不同濃度TNF-α對Caco-2細胞形態的影響

2.2 不同 濃 度TNF-α對Caco-2細 胞 活 力 的 影響CCK-8法檢測結果顯示，對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組細胞活力分別為1.071±0.021、0.767±0.028、0.487±0.021、0.249±0.005；與對照組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組細胞活力下降（P均＜0.05）；低劑量組、中劑量組和高劑量組兩兩比較差異均有統計學意義（P均＜0.05）；TNF-α對Caco-2細胞活性有抑制作用，存在劑量依賴性。

2.3 不同濃度TNF-α對Caco-2細胞中MUC2 mRNA表達的影響RT-qPCR結果顯示，對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組MUC2 mRNA相對表達量分別為1、0.451±0.071、0.159±0.040、0.109±0.001；與對照組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組MUC2 mRNA表達逐漸降低，高劑量組較明顯，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

2.4 不同濃度TNF-α對Caco-2細胞中JNK1和MKK4蛋白表達的影響Western blotting結果顯示，與對照組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組JNK1蛋白表達逐漸升高，高劑量組較明顯，差異均有統計學意義（P均＜0.05）；與對照組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組MKK4蛋白表達升高，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 不同組中JNK1和MKK4蛋白表達比較（±s）

表1 不同組中JNK1和MKK4蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，#P＜0.05；與中劑量組比較，△P＜0.05。

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組JNK1蛋白表達0.444±0.038 0.861±0.040*0.929±0.036*3.501±0.068*#△MKK4蛋白表達1.038±0.056 1.280±0.032*1.297±0.043*4.808±0.111*#△

3 討論

腸屏障中黏液層是保護胃腸道的第一道防線，可有效防止腸上皮細胞層與腸腔內的病原微生物及毒素等的直接接觸，同時在建立共生腸道菌群等方面扮演重要角色［5-6］。目前，雖然對黏液層的調節越來越受到科學界的關注，但因其是一個復雜的動態系統，對其仍知之甚少。MUC2是一種高度糖基化的分泌型黏蛋白，可從杯狀細胞被釋放后形成黏液層的基本骨架，因此是黏液層最主要的結構和功能成分。其可以通過與腸內的樹突狀細胞（DC）相互作用，調控免疫信號的傳遞來阻止腸道抗原的免疫原性，保護腸上皮細胞免遭腔內細菌和食物抗原等的侵害，進而預防腸道炎癥的發生［7］。此外，MUC2的寡糖鏈結構為腸道共生菌提供黏附點，有助于增強益生菌的定殖能力。然而，其合成與分泌的改變均會導致黏液層的變薄，促進病原微生物侵襲和黏附腸上皮細胞，造成腸屏障功能障礙，進而誘發一系列的腸源性疾病發生，如炎癥性腸病、結直腸癌、腸道感染（一系列由寄生蟲、病毒和細菌引起）、其他腸道疾病（如乳糜瀉、囊性纖維化）等［8］。因此，MUC2與許多重要的腸道病理密切相關，在保護腸屏障、調節菌群穩態和預防腸道疾病等方面發揮重要作用［9］。

然而部分炎癥標志物，如TNF-α，可激活NF-κB通路并刺激MUC2的轉錄，而通過JNK通路起到抑制性作用［10］。TNF-α是炎癥反應中的重要介質，主要由活化的巨噬細胞分泌，其主要有3種信號傳導途徑，分別是Caspase家族介導的細胞凋亡、銜接蛋白TRAF介導的轉錄因子NF-κB和JNK蛋白激酶的活化等［11］。一般情況下，生理水平的TNF-α具有免疫調節和抗感染等作用，但其異常水平和持續時間會破壞機體的免疫平衡，導致其他炎癥介質的產生和釋放，擴大炎癥反應的水平，促進急性期蛋白表達，介導創傷后病理改變，引起多器官功能障礙綜合征（MODS）、IBD和CRC等［12-13］。有研究表明，持續高水平的TNF-α會引起急性結腸炎；在腸黏膜損傷過程中，TNF-α活化多形核粒細胞，使其產生大量的氧化劑和蛋白水解酶，最終導致腸屏障功能障礙［14］。與此同時，TNF-α誘導IL-1和IL-6的基因表達，活化磷脂酶A2，使得花生四烯酸分解，生成炎癥介質，從而加重腸道的炎癥反應和缺血缺氧［5］。

c-Jun氨基末端蛋白激酶（JNK）信號通路作為絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）的一個亞家族，是一種細胞應激通路，參與調節多種細胞過程，包括細胞增殖、分化、存活、凋亡和炎癥等［15］。MAPK通路中的每一條通路均通過一系列的磷酸化反應激活，在JNK信號通路中，MAP3K家族上游成員磷酸化并激活MAP2K酶（MKK4和MKK7），進而磷酸化并激活JNK。促炎細胞因子和氧化應激等與腸屏障功能障礙相關的因素均會激活JNK信號通路，如異常的TNF-α信號激活JNK信號通路，形成連接炎癥/應激信號的網絡TNF-α/JNK，隨后，通過轉錄因子c-Jun在轉錄水平上對某基因的表達進行調節［16-17］。本研究中，使用不同濃度的TNF-α干預細胞，6 h后倒置顯微鏡觀察到細胞形態的變化。對照組細胞形態無明顯變化，排列整齊，細胞間緊密連接清晰可見；但用TNF-α處理的3組細胞形態發生變化，由不均一多邊形逐漸轉變為圓形，排列紊亂且細胞間緊密連接逐漸消失。同時CCK-8檢測結果顯示，與對照組相比，其他3組細胞活力下降，差異有統計學意義；表明異常水平的TNF-α對Caco-2細胞活性有抑制作用，并且存在劑量依賴性，隨著TNF-α濃度升高，對Caco-2細胞活性的抑制作用增強。RT-qPCR結果顯示，與對照組相比，其他3組的MUC2 mRNA表達逐漸降低，而Western blotting結果顯示，通路相關蛋白JNK1和MKK4表達逐漸升高，差異均有統計學意義。表明TNF-α經JNK信號通路參與了MUC2表達調控，而MUC2表達改變進一步導致腸屏障功能障礙，誘發一系列的腸源性疾病發生。

綜上所述，異常水平的TNF-α經過JNK信號通路降低MUC2表達，造成腸屏障功能障礙；其機制可能是異常水平的TNF-α激活JNK信號通路，下調MUC2的表達，使得黏液層變薄、通透性增加，促進細菌大量遷移至腸上皮細胞，引起各種腸道疾病。本研究存在以下不足：①僅進行了細胞實驗，并未做到體內-外實驗結合；②僅選擇了單一時間點對細胞進行干預處理，未做時效研究；③本研究中檢測通路相關蛋白時，僅從蛋白水平進行了檢測，未在基因水平對其表達進行驗證。今后尚需進一步研究完善結論。