支氣管哮喘患兒血清lncRNA TUG1、miR-326水平與氣道炎癥的關系

李曉娜，趙和萌，周進進，王娟

連云港市第一人民醫院兒內科，江蘇 連云港 222000

支氣管哮喘（BA）是兒童時期常見的慢性呼吸道炎癥性疾病，近年來，隨著環境污染的加重，兒童BA患病率逐年上升。據統計，我國兒童BA患病率為2.12%［1］，其反復發作不僅嚴重損害患兒身心健康，而且導致兒童誤學率和家長誤工率居高不下，給其家庭乃至社會帶來負擔［2］。盡管目前針對兒童BA的診治已取得較大進展，但仍有超過20%的兒童BA未達到良好控制［3］，研究BA發生、發展的機制是目前研究熱點。氣道炎癥是BA發生、發展的關鍵機制［4］。近年越來越多研究表明，長鏈非編碼RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）等非編碼RNA參與氣道炎癥發生、發展［5-6］。牛磺酸上調基因1（lncRNA TUG1）是新近發現的一種lncRNA，研究報道，lncRNA TUG1在BA大鼠模型中表達上調［7］。miR-326是一種保守的miRNA，研究報道，miR-326在BA氣道平滑肌細胞中表達下調［8］。目前，關于lncRNA TUG1、miR-326與BA患兒氣道炎癥的關系報道較少。本研究我們探討BA患兒血清lncRNA TUG1、miR-326水平與氣道炎癥的關系，旨在為兒童BA防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2019年1月—2022年1月我院收治的106例BA患兒，根據病情嚴重程度分為兩組，急性發作期組43例，男24例、女19例，年齡1～14（7.41±2.68）歲。臨床緩解期組63例，男36例、女27例，年齡1～14（7.35±2.53）歲。另選取同期57例健康兒童為對照組，男32例、女25例，年齡1～14（7.27±2.19）歲。三組性別、年齡比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。BA患兒納入標準：①經肺通氣功能檢測確診，符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》［9］診斷標準；②年齡1～14歲；③臨床資料完整；④患兒家屬或監護人知情并簽署同意書。排除標準：①合并過敏性鼻炎、支氣管擴張、肺結核等氣道內阻塞性疾病或先天性氣道、肺組織發育異常；②合并造血、免疫系統損害；③合并嚴重心肝腎功能損害；④近3個月內使用糖皮質激素；⑤近3個月內呼吸道感染史。本研究經醫院倫理委員會批準（2019-213）。

1.2 觀察指標與方法

1.2.1 血清指標檢測收集BA患兒入院次日清晨和對照組體檢時6 mL空腹靜脈血，3 000 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），取上層血清，分置兩管保存-80℃冰箱至檢測。取1管血清標本，使用TRIzol試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，編號：ALH011）提取血清總RNA，微量分光光度計（賽默飛世爾科技有限公司，型號：NanoDrop）驗證純度、濃度合格（光密度260/280），使用TaKaRa反轉錄試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司，編號：RR036A）合成cDNA。以cDNA為模板，按照SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒（上海赫果生物科技有限公司，編號：DRR820A）進行PCR擴增：lncRNA TUG1正向引物：5＇-GGACACAATTCGCCACGACTT-3＇，反 向 引 物：5＇-GCGCAGTCCCAGATTCCA-3＇；內參GAPDH正向引物：5＇-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3＇，反向引物：5＇-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3＇；miR-326正向引物：5＇-TGAAAGACGTGATGGCACAC-3＇，反向引物：5＇-CTTCCATTTTGGGGTTTTTGG-3＇；內參U6正向引物：5＇-CCCCGTCAGATAATCTGTG-3＇，反向引物：5＇-CTTGTCAGATACGGGAGG-3＇。PCR反應體積20 μL：SYBR?Premix Ex Taq 10 μL、正反向引物各0.8 μL、cDNA模板2.0 μL、ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、RNase Free H2O 6.0 μL；反應條件：95℃90 s、95℃30 s、63℃30 s、72℃15 s共循環40次，收集Ct值，采用2-ΔΔCT法計算血清lncRNA TUG1、miR-326相對表達量。另1管血清標本采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清白細胞介素-4（IL-4）、IL-10、IL-13、干擾素-γ（IFN-γ），試劑盒均購自武漢亞科因生物技術有限公司，編號：KET6015-1、KET6019-1、KET6021-1、KET6011-1。

1.2.2 氣道炎癥指標檢測BA患兒入院次日清晨和對照組體檢時，采用瑞士ANALYZER CLD 88 sp分析儀，通過多重潮氣呼吸法在線測定呼出氣一氧化氮（FeNO），連續測定3次，取平均值。

1.3 統計學方法采用SPSS28.0統計軟件。計量資料符合正態分布以±s表示，多組間比較采用F檢驗，兩兩比較采用t檢驗。偏態分布計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用H檢驗，事后多重比較用Bonferroni校正。Pearson/Spearman相關法分析BA患兒血清lncRNA TUG1、miR-326水平與FeNO和炎癥因子的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組血清lncRNA TUG1、miR-326水平比較對照組、臨床緩解期組、急性發作期組血清lncRNA TUG1水平依次升高，miR-326水平依次降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 三組血清lncRNA TUG1、miR-326水平比較

2.2 三組FeNO和血清炎癥因子水平比較對照組、臨床緩解期組、急性發作期組FeNO和血清IL-4、IL-13水平依次升高，IL-10、IFN-γ水平依次降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 三組FeNO和血清炎癥因子水平比較

2.3 BA患兒血清lncRNA TUG1、miR-326水平與FeNO和炎癥因子的相關性經https：//starbase.sysu.edu.cn/網站預測，lncRNA TUG1與miR-326存在互補序列（圖1）。Pearson/Spearman相關性分析顯示，BA患兒血清lncRNA TUG1水平與miR-326、IL-10、IFN-γ水 平 呈 負 相 關（r分 別 為-0.625、-0.581、-0.667，P均＜0.05），與FeNO和IL-4、IL-13水平呈正相關（r分別為0.701、0.634、0.651，P均＜0.05）；miR-326水平與IL-10、IL-13水平呈負相關（r分別為-0.558、-0.602，P均＜0.05），與FeNO、IL-4、IFN-γ水平呈正相關（r分別為0.689、0.614、0.638，P均＜0.05）。

圖1 lncRNA TUG1與miR-326的互補序列示意圖

3 討論

BA是多種細胞和細胞組分參與的一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應性為特征的異質性疾病，以喘息、咳嗽、胸悶、氣急等癥狀反復發作為主要臨床表現，隨著病情進展可引起氣道增厚狹窄甚至阻塞性通氣功能障礙，嚴重危急患兒生命安全，探索其發病機制有助于早期診斷和提升治療效果［10］。氣道重塑是BA發生、發展以及難以根治的主要原因，慢性、持續的氣道炎癥可導致氣道上皮反復損傷和修復，從而引起炎癥細胞和結構細胞釋放生長因子、趨化因子等多種細胞因子，驅動氣道重塑。因此，抑制氣道炎癥對改善BA肺功能和提升患者生活質量有重要意義［11］。

FeNO是氣道細胞產生的一種生物調節因子，其濃度與氣道炎癥細胞數目呈高度相關，因此被國內外指南作為BA氣道炎癥和BA控制水平的檢測指標［10，12］。氣道炎癥能引起上皮細胞損傷和修復，進而誘導大量炎癥細胞產生，IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ是常見的炎癥細胞因子，其中IL-4、IL-13作為促炎細胞因子，能進一步促進BA進展，IL-10、IFN-γ作為抗炎細胞因子，能通過抑制嗜酸性粒細胞活化、分化和募集等抑制氣道炎癥發展［13-14］。本研究中，對照組、臨床緩解期組、急性發作期組FeNO和血清IL-4、IL-13水平依次升高，IL-10、IFN-γ水平依次降低，說明BA患兒存在明顯氣道炎癥，且與BA進展有關，符合BA病理過程。目前主要認為，BA氣道炎癥啟動和持續過程由遺傳機制、神經調節機制、免疫機制等多種機制共同參與。近年來，隨著表觀遺傳學的深入，發現表觀遺傳學中非編碼RNA調控、組蛋白修飾、DNA甲基化等在BA發生、發展中發揮重要作用［15］。lncRNA是一類新興的表觀遺傳學調控分子，能通過競爭性占有胞內miRNA海綿樣干涉miRNA活性，間接調控靶mRNA表達，進而參與氣道炎癥發生、發 展［5］。lncRNA TUG1定 位 于22號 染 色 體q12.2，最初因其在新生小鼠視網膜細胞中隨著牛磺酸加入而表達上調，故被稱為lncRNA TUG1。多項研究發現，lncRNA TUG1能通過促進核因子-κB（NF-κB）通路活化參與炎癥反應過程，如敲低lncRNA TUG1能抑制NF-κB通路活化來抑制椎間盤盤髓核細胞炎癥和凋亡［16］。lncRNA TUG1能通過促進NF-κB p65轉錄激活NF-κB通路，促進系統性紅斑狼瘡小鼠腎間質炎癥反應［17］。上述研究均提示lncRNA TUG1能通過NF-κB通路參與炎癥反應。氣道平滑肌細胞的異常增殖和遷移是氣道炎癥反應刺激的一個重要表現。近年研究發現，抑制lncRNA TUG1能抑制氣道平滑肌細胞的異常增殖和遷移［18］。本研究結果顯示，對照組、臨床緩解期組、急性發作期組血清lncRNA TUG1水平依次升高，說明血清lncRNA TUG1高水平參與BA發生、發展。進一步分析發現，BA患兒血清lncRNA TUG1水平與FeNO和IL-4、IL-13水平呈正相關，與IL-10、IFN-γ水平呈負相關，提示血清lncRNA TUG1高水平可能通過促進氣道炎癥參與BA發生、發展。分析其機制可能與lncRNA TUG1能促進NF-κB通路活化有關。NF-κB是參與多種炎癥蛋白基因轉錄的重要轉錄調節因子，在BA氣道炎癥中發揮重要作用［19］。體外實驗發現，上調lncRNA TUG1能促進NF-κB信號通路活化，激活氣道炎癥反應［20］。此外，氣道炎癥是BA氣道高反應性的重要原因。近期實驗發現，lncRNA TUG1作為競爭性內源RNA能促進PM2.5暴露誘導的氣道高反應性［21］。

miRNA是一類新興的表觀遺傳學調控分子，能通過降解或抑制蛋白質翻譯調控靶基因表達，參與氣道炎癥發生、發展［6］。miR-326定位于11號染色體q13.4。近年研究發現，miR-326能通過NF-κB通路參與炎癥過程，如上調miR-326能通過Toll樣受體4/髓樣分化初級反應基因88/NF-κB信號通路抑制肝星狀細胞炎癥反應［22］。上調miR-326能靶向程序性細胞死亡因子4使NF-κB信號通路失活，抑制肺炎發展［23］。上述研究說明miR-326參與抑制NF-κB信號通路激活，但關于miR-326與BA患兒氣道炎癥的關系尚未可知。本研究結果顯示，對照組、臨床緩解期組、急性發作期組血清miR-326水平依次降低，說明血清miR-326低水平參與BA發生和發展。進一步分析發現，BA患兒血清miR-326水平與FeNO和IL-4、IL-13水平呈負相關，與IL-10、IFN-γ水平呈正相關，提示血清miR-326低水平可能通過促進氣道炎癥參與BA發生和發展，分析其機制可能與miR-326能抑制NF-κB通路活化有關。環境污染物尤其是PM2.5暴露是誘導RA氣道炎癥的重要原 因［3］。在PM2.5暴 露 誘 導 的 炎 癥 反 應 中，上調miR-326能抑制NF-κBp65的磷酸化，進而抑制NF-κB信號通路激活［24］。同時實驗發現，miR-326能靶向腫瘤壞死因子超家族成員14，抑制氣道平滑肌細胞炎癥、異常增殖和氣道重塑［25］。筆者通過Starbase數據庫預測發現，lncRNA TUG1與miR-326存在互補序列。相關性分析發現，BA患兒血清lncRNA TUG1與miR-326水平呈負相關，提示二者可能共同參與BA患兒氣道炎癥發生、發展。李青華等［26］通過雙熒光素酶實驗也證實，沉默lncRNA TUG1能靶向抑制miR-326，促進BA患兒氣道平滑肌細胞炎癥因子釋放。進一步佐證了本研究結果。

綜上所述，BA患兒血清lncRNA TUG1水平升高，miR-326水平降低，可能共同參與BA患兒氣道炎癥發生、發展。但本研究樣本量較少，關于lncRNA TUG1、miR-326參與BA發生、發展的機制有待進一步研究。