乳腺癌組織中miR-216a-5p、TRIP4表達與患者病理特征和預后的關系

楊金珠，沈磊，宋琪，朱弘艷

1合肥市第三人民醫院腫瘤科，合肥 230022；2安徽省婦幼保健院乳腺外科

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，2020年我國乳腺癌發病率和病死率分別居女性惡性腫瘤第1位和第5位，給女性的生命健康構成嚴重威脅［1］。因此，有必要找到早期預測乳腺癌患者預后的指標。微小RNA（miRNA）是一種小RNA分子，近年研究表明，其參與腫瘤發生、發展［2］。研究報道，miR-216a-5p在食管癌、子宮內膜癌中低表達，與癌細胞增殖、遷移、侵襲有關［3-4］。腫瘤發生、發展過程中存在多種轉錄共激活因子激活，甲狀腺激素受體相互作用蛋白4（TRIP4）是轉錄共激活因子丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉運蛋白1（ACS-1）的一個亞基，研究報道，其與黑色素瘤進展有關［5］。目前，miR-216a-5p、TRIP4在乳腺癌中的作用尚不明確。本研究分析乳腺癌組織中miR-216a-5p、TRIP4表達及與患者病理特征和預后的關系，旨在為早期評估乳腺癌患者預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2018年1月—2019年5月于合肥市第三人民醫院及安徽省婦幼保健院就診的85例乳腺癌患者臨床資料，年齡29～68（44.18±9.87）歲；腫瘤直徑：≥5 cm 31例，＜5 cm 54例；病理類型：浸潤性乳腺癌25例，非浸潤性乳腺癌60例；組織分化程度：低分化32例、中高分化53例；人表皮生長因子受體-2（HER-2）：過表達（免疫組化＞30%的浸潤性癌細胞呈現強且完整均勻的細胞膜著色）17例，低表達68例；Ki-67增殖指數：高增殖指數（免疫組化陽性率≥20%）22例，低增殖指數（免疫組化陽性率＜20%）63例；TNM分期［6］：Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ期28例；有淋巴結轉移30例。納入標準：①經病理檢查確診為乳腺癌；②初診且入院前未接受任何抗腫瘤治療；③患者及家屬均知情研究，并簽署知情同意書；④接受保乳手術或乳房切除術。排除標準：①合并其他部位腫瘤；②臨床資料不完整或者中途失訪者；③合并全身感染性疾病。本研究經醫院倫理委員會批準（2019倫理234號）。

1.2 癌及癌旁組織中miR-216a-5p、TRIP4表達檢測收集術中切除部分癌組織和癌旁組織（保乳手術距離癌組織＞3 cm，乳房切除術距離癌組織＞5 cm），液氮冷凍研磨后使用TRIzol試劑盒提取組織RNA，TaKaRa試劑盒反轉錄合成cDNA，Narodrop驗證cDNA濃度及純度，使OD260/OD280為1.8～2.0。SYBR Green Master Mix qRT-PCR試劑盒檢測組織中miR-216a-5p、TRIP4表達。miR-216a-5p正向引物：5＇-GGGTAATCTCAGCTGGCAA-3，反向引物：5＇-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3＇；內 參U6正 向 引 物：5＇-GGCACCCAGCACAATGAA-3＇；反 向 引 物：5＇-TAGAAGCATTTGCGGTGG-3＇。TRIP4正向引物：5＇-GGACUAGAGUUCAACUCAUTT-3＇，反向引物：5＇-AUGAGUUGAACUCUAGUCCTT-3＇；內參β-actin正向引物：5＇-ATCACCATTGGCAATGAGCG-3＇；反向引物：5＇-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3＇。反應體系共20μL：cDNA 2μL、正反向引物各1μL、2×Taq Master 10μL、雙蒸水6μL；反應條件：95℃2 min、95℃30 s、62℃30 s、72℃30 s共循環40次。采用2-ΔΔCt法計算miR-216a-5p、TRIP4相對表達量。

1.3 隨訪患者出院后通過門診或電話方式隨訪3年，統計術后3年無進展生存率（治療后至腫瘤進展或任何原因死亡或隨訪截止）和3年總生存率（治療后至任何原因死亡或隨訪截止）。

1.4 統計學方法采用SPSS26.0統計軟件。計量資料符合正態分布以±s表示，比較采用t檢驗；計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗；采用Pearson相關性分析乳腺癌組織中miR-216a-5p與TRIP4表達的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌及癌旁組織中miR-216a-5p、TRIP4表達比較乳腺癌組織中miR-216a-5p、TRIP4相對表達量分別為0.430±0.109、1.886±0.388，癌旁組織中分別為1.012±0.166、1.023±0.171，乳腺癌組織中miR-216a-5p表達低于癌旁組織，TRIP4表達高于癌旁組 織（t分別為26.954、18.743，P均＜0.05）。

2.2 乳腺癌組織中miR-216a-5p與TRIP4表達的相關性Pearson相關性分析顯示，乳腺癌組織中miR-216a-5p與TRIP4表 達 呈 負 相 關（r=-0.637，P＜0.05）。

2.3 乳腺癌組織中miR-216a-5p、TRIP4表達與患者臨床病理特征的關系乳腺癌組織中miR-216a-5p、TRIP4表達與患者HER-2表達、Ki-67增殖指數、TNM分期、淋巴結轉移有關（P均＜0.05），與年齡、腫瘤直徑、病理類型、分化程度、雌激素受體、孕激素受體無關（P均＞0.05）。見表1。

表1 乳腺癌組織中miR-216a-5p、TRIP4表達與患者臨床病理特征的關系

2.4 乳腺癌組織中miR-216a-5p、TRIP4表達與患者無進展生存期和總生存期的關系隨訪6～36個月，85例乳腺癌患者3年無進展生存率和總生存率分別為71.76%（61/85）、83.53%（71/85）。以乳腺癌組織中miR-216a-5p、TRIP4表達均值為基準分為miR-216a-5p高表達組（≥0.430）44例、miR-216a-5p低表達組（＜0.430）41例、TRIP4高表達組（≥1.886）42例和TRIP4低表達組（＜1.886）43例，miR-216a-5p高表達組3年無進展生存率和總生存率分別為81.82%（36/44）、93.18%（41/44），miR-216a-5p低表達組分別為60.98%（25/41）、73.17%（30/41），miR-216a-5p高表達組3年無進展生存率和總生存率與miR-216a-5p低表達組比較差異均有統計學意義（χ2分別為4.550、6.177，P均＜0.05）；TRIP4高表達組3年無進展生存率和總生存率分別為61.90%（26/42）、71.43%（30/42），TRIP4低表達組分別為81.40%（35/43）、95.35%（41/43），TRIP4高表達組3年無進展生存率和總生存率與TRIP4低表達組比較差異均有統計學意義（χ2分別為3.983、8.836，P均＜0.05）。

3 討論

乳腺癌由乳腺上皮細胞增殖失控進而惡變形成，其發生、發展與多種基因異常表達密切相關［7-9］。盡管近年來手術、放化療、免疫和靶向治療取得一定進展，乳腺癌患者預后得到一定程度改善，但部分乳腺癌患者在確診時已存在轉移，目前尚無治愈方法，預后較差，因此還需進一步探索其發生、發展機制，以促進乳腺癌治療策略完善［10-11］。

miRNA是一類小分子RNA，能通過結合靶基因3'-非翻譯區導致靶基因轉錄后沉默，從而調控細胞增殖、分化、遷移、自噬、周期阻滯、糖酵解、凋亡、DNA損傷修復等功能，影響癌癥進展［12-13］。如miR-492能靶向抑制細胞因子信號抑制因子2促進乳腺癌增殖、遷移和侵襲［12］。miR-425-5p能靶向抑制第10號染色體上缺失的磷酸酶和緊張素同源物促進乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲［13］。miR-216a-5p位于染色體2p16.1，是一個與糖尿病發生密切相關的miRNA。PANG等［14］研究報道，miR-216a-5p能通過調控Rap2B抑制小細胞肺癌細胞增殖、遷移、侵襲和誘導凋亡。PAN等［15］研究顯示，miR-216a-5p能通過下調SRY盒轉錄因子5抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲、自噬和誘導凋亡。本研究結果顯示，與癌旁組織比較，乳腺癌組織中miR-216a-5p表達降低，提示miR-216a-5p可能在乳腺癌發展中發揮作用。癌細胞是一種變異細胞，具備無限增殖能力，能通過促進增殖和抑制凋亡而無限增殖，導致淋巴結或其他部位轉移，從而促進癌細胞的發展，導致預后不良。本研究結果還顯示，乳腺癌組織中miR-216a-5p表達與HER-2表達、Ki-67增殖指數、TNM分期、淋巴結轉移有關，進一步說明miR-216a-5p參與乳腺癌惡性發展，其機制可能與miR-216a-5p能抑制p21蛋白激活激酶2（PAK2）表達有關。PAK2是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能被生長因子和胞外信號活化，調節細胞周期、有絲分裂、凋亡和血管生成、基因轉錄調節等生物學過程，在腫瘤發生、發展中發揮重要作用。ZHANG等［16］研究報道，上調miR-216a-5p能靶向抑制PAK2表達，進而抑制乳腺癌細胞增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力。本研究結果顯示，miR-216a-5p高表達組3年無進展生存率和總生存率明顯升高，說明miR-216a-5p可能成為預測乳腺癌的一個新的生物標志物和一個新的治療靶點。

ASC-1是負責橋接轉錄因子或重塑染色質結構的因子，亦是轉錄因子Ap1、血清反應因子、核因子-κB的共激活因子。早期研究指出，ASC-1的UFMylation是雌激素受體α反式激活的關鍵步驟，ASC-1過表達能促進雌激素受體α介導乳腺癌形成［17-18］。而TRIP4作為ASC-1的亞基，介導基礎轉錄因子轉錄和活化，因此，我們推測TRIP4可能參與乳腺癌進展。目前，關于TRIP4與腫瘤關系的研究剛起步，最初HAO等［5］研究發現，黑色素瘤中TRIP4高表達，并通過激活核因子-κB上調環氧合酶-2和誘導型一氧化氮合酶表達，促進黑色素瘤增殖、遷移、侵襲，且抑制TRIP4能提升抗鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1靶向藥物的敏感性。基于TRIP4對腫瘤的影響，近期CHE等［19］研究發現，TRIP4在宮頸癌中高表達，能通過激活絲裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、人端粒酶逆轉錄酶信號通路，促進宮頸癌生長和轉移，并降低宮頸癌放療敏感性。本研究結果顯示，與癌旁組織比較，乳腺癌組織中TRIP4表達升高，提示TRIP4可能在乳腺癌發展中發揮作用。進一步分析顯示，乳腺癌組織中TRIP4表達與HER-2表達、Ki-67增殖指數、TNM分期、淋巴結轉移有關，說明TRIP4參與乳腺癌惡性發展，可能與TRIP4能激活多種信號通路有關［19］，但關于TRIP4參與乳腺癌的機制還需進一步證實。本研究結果顯示，相比TRIP4低表達組，TRIP4高表達組3年無進展生存率和總生存率明顯降低，說明TRIP4亦可能成為預測乳腺癌的一個新的生物標志物和一個新的治療靶點。本研究進一步分析發現，乳腺癌組織中miR-216a-5p與TRIP4表達呈負相關，提示miR-216a-5p與TRIP4可能共同參與了乳腺癌惡性進展，分析與TRIP4為miR-216a-5p的下游調控靶點有關。楊霞等［20］通過雙熒光素酶報告基因實驗證實，上調miR-216a-5p能靶向抑制TRIP4表達，進而抑制乳腺癌細胞增殖和促進凋亡。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-216a-5p低表達，TRIP4高表達，與HER-2表達、Ki-67增殖指數、TNM分期、淋巴結轉移和預后有關，可能成為評估乳腺癌預后的標志物。