胃癌組織中miR-143-3p、LASP1表達與臨床病理特征和預后的關系

沈美琴，施穎琦，陸飛，葛振明，錢俊波

南通市第一人民醫院消化內科，江蘇 南通 226000

胃癌是常見的惡性腫瘤之一。2020年我國胃癌新發病例47.9萬例，死亡37.4萬例，疾病負擔較重［1］。盡管近年來隨著內鏡技術的普及，早期胃癌的檢出率逐年上升，但大多胃癌患者在診斷時已處于進展期，即使接受根治性切除，預后仍較差［2］。因此還需進一步了解胃癌發生、發展的驅動因素。微小RNA（miRNA）通過調控基因轉錄參與腫瘤發生、發展［3］。miR-143-3p是miRNA家族的一種高度保守成員。研究報道，miR-143-3p在肺癌、口腔鱗癌中異常表達，參與腫瘤細胞惡性進展［4-5］。研究表明，肌動蛋白細胞骨架改變參與腫瘤發生、發展［6］。LIM和Src同源結構域3蛋白1（LASP1）是LIM（LIN11、ISL1、MEC3）蛋白亞家族的一種細胞骨架支架蛋白，參與維持肌動蛋白穩定性［7］。目前，關于胃癌組織中miR-143-3p、LASP1表達與臨床病理特征和預后的關系尚少見報道。本研究我們探討了胃癌組織中miR-143-3p、LASP1表達及其與臨床病理特征和預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2017年1月—2018年1月本院收治的113例接受姑息性或根治性手術的胃癌患者，其中男52例、女61例，年齡43～78（60.35±6.35）歲；腫瘤部位：賁門或胃底39例、胃體20例、胃竇54例；腫瘤直徑：≥3 cm 61例、＜3 cm 52例；分化程度：低分化45例、中高分化68例；TNM分期［8］：Ⅰ期32例、Ⅱ期47例、Ⅲ期34例；淋巴結轉移52例。納入標準：經術后病理檢查確診為胃癌；初診且入院前未接受抗腫瘤治療；患者及家屬均知情并簽署同意書。排除標準：合并其他腫瘤、全身感染、嚴重心、肝、腎功能損害；年齡＜18歲。本研究經醫院倫理委員會批準（2019KS095）。

1.2 胃癌組織中miR-143-3p、LASP1表達檢測收集術中切除部分癌組織和癌旁正常組織（距癌組織＞5 cm），TRIzol試劑盒（上海冠泰生物科技有限公司，編號：A2010A0401）提取組織總RNA，Nano-300微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）驗證純度、濃度合格，使用反轉錄試劑盒（日本TaKaRa Bio，編號：RR037B）反轉錄合成cDNA，反轉錄體積10μL：5×

PrimeScript RT Master Mix 2.0 μL、RNA 2.0 μL、

RNase Free H2O 6.0μL；反應條件：37℃15 min、85℃5 s、4℃5 min反應至結束后保存于-20℃冰箱中。以cDNA為模板按照SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒（日本TaKaRa Bio，編號：RR902A）進行PCR擴增。miR-499a-5p正向引物：5＇-GCGCGCTACAGTATAGATGATG-3＇，反向引物：5＇-GCTGTCAACGATACGCTACG-3＇；內 參U6正 向 引 物：5＇-GCGCGCGCGGGCAGGG-3＇，反向引物：5＇-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3＇；LASP1正向引物：5＇-TGCGGCAAGATCGTGTATCC-3＇，反向引物：5＇-GCAGTAGGGCTTCTTCTCGTAG-3＇；內參GAPDH正向引物：5＇-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3＇，反向引物：5＇-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3＇。引物序列由上海新貝生物科技有限公司設計和合成。PCR反應體積20μL：SYBR?Premix Ex Taq 10μL、正反向引物各0.8 μL、cDNA模板2.0 μL、ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、RNase Free H2O 6.0 μL；反應條件：95℃90 s、95℃30 s、63℃30 s、72℃15 s，循環40次后收集Ct。采用2-ΔΔCt法計算組織中miR-143-3p、LASP1 mRNA相對表達量。

1.3 隨訪所有患者出院后通過門診或電話方式隨訪3年，隨訪截止到2021年1月，根據胃癌組織中miR-143-3p、LASP1 mRNA表達的中位數分為高低表達者，統計不同表達的胃癌患者總生存率。

1.4 統計學方法采用SPSS28.0統計軟件。計量資料符合正態分布以±s表示，比較采用t或F檢驗；偏態分布以M（P25，P75）表示，比較采用U或H檢驗。采用Spearman相關性系數進行相關性分析；Kaplan-Meier法繪制胃癌患者生存曲線，組間生存率比較采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌及癌旁組織中miR-143-3p、LASP1 mRNA表達比較胃癌、癌旁組織中miR-143-3p相對表達量分別為1.42（1.21，1.66）、3.63（2.90，4.33），二者比較差異有統計學意義（U=12.531，P＜0.01）；胃癌、癌旁組織中LASP1 mRNA相對表達量分別為2.12（1.96，2.26）、1.18（1.03，1.32），二者比較差異有統計學意義（U=12.753，P＜0.01）。

2.2 胃癌組織中miR-143-3p與LASP1 mRNA表達的相關性經TargetScan數據庫http：//www.targetscan.org/預測發現，LASP1的3'-非翻譯區1683至1689堿基處存在與miR-143-3p的結合位點（圖1）。Spearman相關性分析顯示，胃癌組織中miR-143-3p與LASP1 mRNA表達呈負相關（r=-0.810，P＜0.01）。

圖1 miR-143-3p與LASP1的結合位點示意圖

2.3 胃癌組織中miR-143-3p、LASP1 mRNA表達與臨床病理特征的關系胃癌組織中miR-143-3p、LASP1 mRNA表達呈與TNM分期和淋巴結轉移有關（P均＜0.05），見表1。

表1 胃癌組織中miR-143-3p、LASP1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系

2.4 胃癌組織中miR-143-3p、LASP1 mRNA表達與患者預后的關系隨訪3年，113例胃癌患者中死亡35例，無失訪病例，總生存率為69.03%（78/113）。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，miR-143-3p高表達（≥1.42）者57例，3年總生存率為82.46%（47/57）；miR-143-3p低表達（＜1.42）者56例，3年總生存率為55.36%（31/56），miR-143-3p高表達者與低表達者3年總生存率比較差異有統計學意義（χ2=9.735，P＜0.05）。LASP1 mRNA高表達（≥2.12）者55例，3年總生存率為58.18%（32/55）；LASP1 mRNA低表達（＜2.12）者58例，3年總生存率為79.31%（46/58），LASP1 mRNA高表達者與低表達者3年總生存率比較差異有統計學意義（χ2=6.511，P＜0.05）。

3 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，我國70.8%的初診胃癌存在局部進展［9］，晚期胃癌患者5年累積生存率不足30%［10］。近年來，以個體化、精準化為特征的免疫和靶向治療雖然為進展期胃癌的治療提供了新的方向，但尚未達到滿意效果。對部分進展期胃癌和晚期胃癌療效仍然較差，有必要進一步了解胃癌發生、發展的相關分子機制，不僅有助于胃癌進展和預后評估，亦有助于開放新的治療方案，對延長胃癌患者生存期有重要意義。

非編碼RNA組成了生物體細胞內復雜的RNA調控網絡，廣泛參與腫瘤細胞各種生物學過程，miRNA是一種新發現的小分子非編碼RNA，通過與mRNA的3'-非翻譯區結合而降解或抑制其翻譯而參與基因調控，在腫瘤中發揮癌基因或抑癌基因功能［11-12］。miR-143-3p定位于人染色體5q32，是一種高度保守的miRNA。近年多項研究報道其與惡性腫瘤的關系，如郭亮等［13］研究報道，miR-143-3p在前列腺癌中低表達，能靶向三葉因子3抑制前列腺癌細胞增殖。WANG等［14］研究報道，miR-143-3p在腦轉移瘤中高表達，能靶向調控血管抑制素-1促進腦轉移瘤侵襲。這些研究提示，在不同腫瘤中miR-143-3p發揮不同作用。本研究結果顯示，胃癌組織中miR-143-3p表達下調，提示miR-143-3p可能在胃癌發生、發展中發揮作用，其在胃癌中表達下調可能與miR-143-3p啟動子甲基化有關。進一步分析顯示，胃癌組織中miR-143-3p表達下調、TNM分期增加和淋巴結轉移有關，提示miR-143-3p在胃癌中發揮抑癌基因作用，其低表達能促進胃癌進展，可能與miR-143-3p下調導致絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7上調有關。炎癥是腫瘤發生、發展的關鍵機制之一，絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7是炎癥信號轉導的關鍵介質，能被多種細胞因子刺激激活，促進核因子-κB活化，進而促進腫瘤進展［15-16］。FAN等［17］研究證實，胃癌中miR-143-3p能靶向下調絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7，抑制胃癌細胞增殖、侵襲和遷移，而抑制miR-143-3p能發揮相反作用。

肌動蛋白是一類存在所有真核細胞中的微絲球狀多功能蛋白質，能在細胞骨架和肌纖維中形如細絲，以維持細胞形態和保護細胞內部結構，進而參與諸多重要生命活動。當肌動蛋白細胞骨架異常時可引起細胞形態和結構紊亂，促進細胞異常增殖、遷移，在腫瘤發生、發展過程中發揮重要作用［6］。LIM是參與調節肌動蛋白細胞骨架形成的半胱氨酸富集蛋白，LASP1作為LIM蛋白亞家族的一員，在維持肌動蛋白穩定性中發揮重要作用，當細胞骨架異常時可引起LASP1大量表達［18-19］。研究發現，LASP1還存在于信號轉導蛋白和轉錄因子中，能介導細胞內信號轉導，同時基于肌動蛋白細胞骨架與腫瘤的密切關系。研究發現，LASP1表達上調與惡性腫瘤的增殖、遷移和侵襲有關［20-21］。近年研究發現，沉默LASP1能抑制胃癌細胞增殖、侵襲和轉移能力。然而鮮見研究報道LASP1對胃癌的臨床意義。本研究結果顯示，胃癌組織中LASP1表達上調，這與劉玉珍等［22］報道一致，提示LASP1可能在胃癌發生、發展中發揮作用，其在胃癌中表達上調可能與胃癌細胞異常增殖等破骨細胞骨架有關。進一步分析顯示，胃癌組織中LASP1表達上調、TNM分期增加和淋巴結轉移有關，提示LASP1在胃癌中發揮促癌基因作用，其機制可能與LASP1表達上調反映胃癌細胞骨架異常，導致腫瘤細胞異常增殖、遷移。近年研究發現，下調LASP1表達能通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B途徑抑制細胞增殖和遷移，導致細胞周期停滯［23-24］。本研究分析miR-143-3p、LASP1 mRNA與胃癌患者預后關系發現，miR-143-3p高表達和LASP1 mRNA低表達胃癌患者生存率更高，說明miR-143-3p和LASP1或可成為胃癌患者預后評估指標。本研究通過TargetScan數據庫預測發現，LASP1的3'-非翻譯區與miR-143-3p的結合位點，相關性分析也發現，胃癌組織中miR-143-3p與LASP1 mRNA表達呈負相關，提示miR-143-3p與LASP1可能共同參與胃癌發生、發展。許鑫鑫等［25］通過實驗也證實，上調miR-143-3p能靶向下調LASP1，抑制胃癌細胞的侵襲和遷移。本研究結果與之相符。

綜上所述，miR-143-3p在胃癌中低表達，LASP1 mRNA在胃癌中高表達，二者可能共同參與胃癌進展，與TNM分期、淋巴結轉移和預后有關，但本研究結果有待多中心進一步研究證實。