高效液相色譜法測定手沖咖啡中綠原酸與咖啡酸含量

袁棟勇，周湧智，毛瑋琪，畢建辛，張黔文，紀曉娜，2*

（1.長春工程學院 理學院，長春 130012；2.吉林省城市污水處理重點實驗室，長春 130012）

隨著越來越多的人開始飲用咖啡，咖啡行業市場前景良好，咖啡的有效成分和安全性受到人們的關注。在咖啡豆烘焙過程中會產生各種各樣的有機酸類物質[1]，包括綠原酸、咖啡酸和無水檸檬酸等30多種有機酸[2]，其中綠原酸不僅是咖啡豆中含量較高的風味物質，還具有很多生物功效，例如抗菌、抗氧化和抗腫瘤等；咖啡酸具有調血脂、抗氧化的作用。但如果人體飲用綠原酸、咖啡酸含量過多，也會對人體造成巨大的損害。根據CAS數據庫顯示[3]，綠原酸毒性很小，對小鼠半數致死量（LD50）大于1 g·kg-1，折算人體60 kg體重個體，半數致死量60 g；根據毒理學研究表示[4]，咖啡酸小鼠半數致死量（LD50）為4.85±0.47 g·kg-1，折算人體60 kg體重個體，半數致死量262.8～319.2 g。目前對咖啡豆的研究主要集中于加工方式對咖啡豆成分含量的影響[5-7]及功能研究等[8]，而探究不同產地咖啡豆制作手沖咖啡中的綠原酸和咖啡酸含量及手沖咖啡中綠原酸和咖啡酸含量的安全性研究則較少。為了進一步探究不同產地咖啡豆制作手沖咖啡中的綠原酸和咖啡酸含量及安全性問題，選取市面上常見的5種咖啡豆，采用高效液相色譜（HPLC）的方法檢測這5種產地咖啡豆在手沖條件下綠原酸、咖啡酸2種風味物質含量。數據可用于分析手沖咖啡中的綠原酸和咖啡酸對人體是否安全。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純，山東禹王實業有限公司化工分公司）；乙酸（色譜純，佛山西隴化工有限公司）。5種咖啡豆（長沙萬物食品貿易有限公司）。綠原酸（色譜純，上海源葉生物科技有限公司）；咖啡酸（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀，Poroshell 120 ECC18型高效液相色譜柱（美國安捷倫公司）；手搖磨豆機；針式濾膜（0.45 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件[9]

流動相A：0.5%乙酸水溶液；流動相B：乙腈。V（A）∶V（B）=95∶5，流速：1 mL·min-1；進樣量10 μL；柱溫：35℃；多波長紫外檢測器，波長：285 nm[10]。

1.3.2 標準品溶液的配制

精密稱取綠原酸標準品和咖啡酸標準品20.0 mg，分別移至10 mL容量瓶和50 mL容量瓶中，并用超純水定容，得到標準母液綠原酸（2 000 mg·L-1）和咖啡酸（400 mg·L-1）。

1.3.3 標準品標準梯度溶液的配制

以超純水稀釋定容至10 mL，得到1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、300.0 mg·L-1的綠原酸和1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg·L-1的咖啡酸系列標準溶液，均稀釋10倍待測。

1.3.4 樣品前處理方法

用手搖磨豆機將咖啡豆打碎，楊青山等[11]研究表明，將不同咖啡豆粉碎至40目、通過率80%以上細度，每次磨碎后多次清洗磨豆機，保證下一次無雜質出現，將篩上物和篩下物混合均勻后，作為待測咖啡豆。分別取5種地區的待測咖啡豆，分別準確稱取9.000 g置于咖啡濾紙中，加入200.0 mL 95℃的超純水，勻速攪拌使咖啡中的物質更好地溶解，冷卻后取樣，分別取0.100 mL溶解液，定容于2 mL樣品瓶中，定容（稀釋10倍）過0.45 μm濾膜，置于另一樣品瓶中，待測。

2 結果與分析

2.1 定性和定量分析

利用保留時間（tR）定性分析，將1.3.4中的標準品標準梯度溶液進行檢測，以標準品濃度（c）為X軸，以峰面積（A）為Y軸，得到綠原酸和咖啡酸的梯度工作曲線，采用外標法定量分析，結果見表1。

表1 定性和定量分析相關數據

2.2 5種手沖咖啡樣品的檢測

將1.3.4的待測液分別進行HPLC檢測，以中國云南省小粒咖啡為例，色譜圖如圖1所示。5種產地咖啡豆制作的手沖咖啡中綠原酸和咖啡酸結果見表2。

表2 5種手沖咖啡中綠原酸和咖啡酸的檢測數據

圖1 中國云南省小粒手沖咖啡的高效液相色譜圖

2.3 精密度檢驗

對5種產地咖啡做7次平行測試，得到綠原酸的平均質量濃度、標準偏差（S）和相對標準偏差（見表3）。

表3 綠原酸測量數據表

2.4 加標回收試驗

取巴布亞新幾內亞拉瑪莉水樣，按照以下條件對水樣進行3次水平加標回收試驗，結果見表4。實驗測得綠原酸的加標回收率為83.6%～96.0%，咖啡酸的加標回收率為92.4%～95.8%，說明檢測方法可靠。

表4 加標回收率

2.5 最低檢出限

將含有已知濃度的綠原酸和咖啡酸的標準溶液多次稀釋至0.007 mg·L-1和0.004 mg·L-1，信噪比（S/N）分別為2.58和3.37（在2～5的范圍內）。確定最低檢出限為綠原酸0.007 mg·L-1和咖啡酸0.004 mg·L-1。

3 結論

綜上所述，5種不同產地咖啡豆手沖咖啡中的綠原酸大致含量分別為1.943、3.097、1.334、1.940和2.542 g·kg-1。中國云南省小粒咖啡豆手沖咖啡中咖啡酸含量為0.020 g·kg-1，其余咖啡豆制作的手沖咖啡中咖啡酸未檢出。本試驗方法經精密度、加標回收率和最低檢出限等試驗驗證，其相對標準偏差均在規定的誤差范圍內，說明該處理方法及色譜條件適用于手沖咖啡咖啡豆中綠原酸和咖啡酸的定量分析，方法準確可行。

同時，根據綠原酸和咖啡酸對人體的半數致死量，可以估算出以上5種手沖咖啡的人體最大飲用量范圍為19.37～44.98 kg；中國云南省小粒咖啡的人體最大飲用量為13 100 kg。結合人體日常服用咖啡量，可以得出人體日常飲用手沖咖啡對人體無害。

綜上所述，本試驗確定了一種簡單、快速并能準確測定手沖咖啡中綠原酸和咖啡酸含量的高效液相色譜方法。同時，通過分析，人體日常飲用手沖咖啡中的綠原酸和咖啡酸對人體無害，為咖啡豆質量安全的評定提供了可行的參考方法。