龜齡酒薄層色譜條件的優(yōu)選*

張 拓，曹 斌，陳加諾,陳 姍，宋 琳，馮鎖民**，李惠民，楊 祎，崔 喆，梁 超，沈丹彤，高科論

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西醫(yī)藥控股集團(tuán)山海丹藥業(yè)股份有限公司，陜西 西安 710075；3.中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)，陜西 西安 710032；4.商洛職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 商州 726000；5.陜西學(xué)前師范學(xué)院，陜西 西安 710061)

龜齡酒為醫(yī)院制劑，該方由人參、淫羊藿、鹿茸、海馬等19味名貴中藥組成，具有補(bǔ)腎壯陽、健脾和胃、養(yǎng)血益精、增進(jìn)食欲、延緩衰老、抗疲勞的功效，用于治療腎陽虛衰、氣血不足等癥[1-2]。龜齡酒以龜齡命名，取其長壽之意，乾隆皇帝盛贊“龜齡集乃補(bǔ)酒至尊”。由于該品種原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沒有薄層定性檢測(cè)項(xiàng)目，按照陜西省藥監(jiān)局藥品注冊(cè)處的要求，必須限期對(duì)該醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升，為此，重點(diǎn)對(duì)處方中的君藥人參和淫羊藿等，進(jìn)行了薄層色譜鑒別方法的研究，為該產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、環(huán)己烷、乙醚、氨水：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；薄層硅膠G：化學(xué)純，青島海洋化工有限公司；羧甲基纖維素鈉：化學(xué)純，上海山浦化工有限公司；水：高純水。人參皂苷Rg：批號(hào)0703-200119；人參皂苷Re：批號(hào)110754-200822；淫羊藿苷：批號(hào)110737-200415；以上對(duì)照品均購于中國藥品生物制品檢定所。龜齡酒：260 mL/瓶,批準(zhǔn)文號(hào)陜藥管制字(2001)第2900號(hào)，西安航天總醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。

電子天平：ALC-210.4,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-2000A，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電熱恒溫水浴鍋：DZKW-D-2，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；超聲波清洗器：KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司；三用紫外分析儀：ZF-7型，上海嘉鵬科技有限公司；循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9140B，上海安亭科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 龜齡酒中人參的薄層鑒別

1.2.1.1 人參皂苷Re對(duì)照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Re對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg人參皂苷Re的對(duì)照品溶液。

1.2.1.2 人參皂苷Rg1對(duì)照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rg1約2 mg，加甲醇1 mL使溶解。

1.2.1.3 供試品溶液的制備[3-5]

取50 mL龜齡酒，水浴蒸至無酒精味，用處理過的D-101型大孔樹脂浸泡吸附并裝柱，分別用純化水、30%乙醇洗脫至無顏色，棄去洗脫液。再用70%乙醇洗至無顏色，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0 mL水飽和的正丁醇溶解，用氨試液洗3次(10 mL×3)，搖勻，放置分層，取上層液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

1.2.1.4 人參對(duì)照藥材溶液的制備

取人參對(duì)照藥材1 g，加三氯甲烷40 mL，加熱回流1 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，加水0.5 mL攪拌濕潤，加水飽和正丁醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液加氨試液洗3次(20 mL、15 mL、10 mL)，搖勻，放置分層，取上層液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為人參對(duì)照藥材溶液。

1.2.1.5 陰性供試品溶液的制備

按龜齡酒制備方法，去掉處方中人參藥材，制備缺人參的龜齡酒，按1.2.1.3方法制備缺人參的陰性供試品溶液。

1.2.1.6 薄層方法

照《中國藥典》2020版四部0502薄層色譜法試驗(yàn)[6]，吸取上述5種溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(體積比15∶40∶22∶10)低于10 ℃放置的下層溶液為展開劑，飽和15 min，上行展開8 cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外燈365 nm下檢視。

1.2.2 龜齡酒中淫羊藿的薄層鑒別

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

稱取淫羊藿苷加甲醇制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液[7]。

1.2.2.2 供試品溶液的制備

取龜齡酒50 mL，水浴蒸干，殘?jiān)右掖?0 mL超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，加純化水10 mL溶解，用乙酸乙酯萃取2次(15 mL×2)，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

1.2.2.3 陰性供試品溶液的制備

按龜齡酒處方，去掉淫羊藿制成藥酒，按1.2.2.2方法制成不含淫羊藿藥材的陰性樣品溶液。

1.2.2.4 薄層方法

按《中國藥典》2020版四部0502薄層色譜法試驗(yàn)[6]，吸取上述3種溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)低于10 ℃放置12 h的下層溶液為展開劑，飽和15 min，上行展開8 cm，取出，晾干，噴以5%的三氯化鋁乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外燈365 nm下檢視。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 龜齡酒中人參的薄層結(jié)果

龜齡酒中人參的薄層結(jié)果見圖1。

日光下

由圖1可知，供試品色譜中在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上分別顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，陰性供試品在對(duì)應(yīng)位置無斑點(diǎn)，表明該色譜條件分離良好，陰性供試品無干擾，龜齡酒中含有人參藥材。

2.1.2 龜齡酒中淫羊藿的薄層結(jié)果

龜齡酒中淫羊藿的薄層色譜結(jié)果見圖2。

(紫外線365 nm照射下)圖2 龜齡酒中淫羊藿藥材的薄層色譜圖

由圖2可知，供試品色譜中，在與淫羊藿苷對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照在相應(yīng)位置無熒光斑點(diǎn)出現(xiàn)。表明該色譜條件分離良好，陰性供試品無干擾，龜齡酒中含有淫羊藿苷。

2.2 討論

2.2.1 龜齡酒中人參供試品溶液制備方法篩選

為了獲得理想的薄層分離效果，對(duì)龜齡酒中人參供試品溶液處理方法進(jìn)行了4種篩選，見表1。從表1薄層結(jié)果及原因分析可以看出，在中國藥典[8]單味人參藥材供試品處理方法(1)基礎(chǔ)上，進(jìn)行改良，通過D-101型大孔樹脂富集除去水溶性及極性較大成分，篩選出的方法(4)，即正文1.2.1.3方法為最佳方法，薄層效果最為理想。

表1 龜齡酒中人參供試品溶液處理方法的篩選

2.2.2 龜齡酒中淫羊藿供試品溶液制備方法的篩選

為了得到合適的樣品處理方法，對(duì)龜齡酒中淫羊藿樣品的處理方法分別按表2進(jìn)行了2種方法的比較，方法(2)即正文1.2.2.2之法，由于在方法[8](1)基礎(chǔ)上增加了用水溶解，乙酸乙酯萃取步驟，除去了樣品中水溶性極性大成分和極性小成分的干擾[9-10]，所得薄層色譜斑點(diǎn)圓整，較集中，因此1.2.2.2為龜齡酒中淫羊藿供試品處理的最佳方法。

表2 龜齡酒中淫羊藿供試品溶液制備方法篩選

2.2.3 龜齡酒中淫羊藿樣品薄層展開溶劑系統(tǒng)篩選

對(duì)龜齡酒中淫羊藿樣品的薄層展開溶劑系統(tǒng)分別按表3進(jìn)行了3種篩選，(1)展開溶劑系統(tǒng)薄層結(jié)果嚴(yán)重拖尾，斑點(diǎn)不清晰，不合適。(2)和(3)展開系統(tǒng)的薄層色譜分別見圖3和圖2，從圖3可以看出，采用(2)展開溶劑系統(tǒng)，斑點(diǎn)清晰可見，但對(duì)照品斑點(diǎn)拖尾，且RF值太小。以(3)三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)(10 ℃放置12 h后取下層)作為展開劑展開后，供試品在對(duì)照品相應(yīng)位置上斑點(diǎn)集中，拖尾較少，因此最終選用三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)下層作為龜齡酒中淫羊藿薄層展開溶劑系統(tǒng),薄層結(jié)果見圖3。

表3 龜齡酒中淫羊藿樣品薄層展開劑篩選

龜齡酒中淫羊藿以環(huán)己烷-正丁醇-水(體積比1∶1∶2)為展開劑的TLC結(jié)果見圖3。

紫外光365 nm圖3 龜齡酒中淫羊藿以(2)環(huán)己烷-正丁醇-水(1∶1∶2)為展開劑的TLC色譜圖

3 結(jié) 論

龜齡酒為醫(yī)院制劑，在西安航天總醫(yī)院已使用多年，為了使該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)能夠符合醫(yī)院制劑注冊(cè)的新要求，本實(shí)驗(yàn)所確定的處方中君藥人參、淫羊藿等藥材薄層色譜鑒別方法，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性良好，可用于龜齡酒主要藥材的定性質(zhì)量控制，同時(shí)也為質(zhì)量標(biāo)椎準(zhǔn)提高提供科學(xué)依據(jù)。