湖北海棠化學成分研究

張 曼,鞠炎錕，梅之南，熊 慧

(中南民族大學 藥學院,湖北 武漢 430074)

1 引言

湖北海棠(Malushupehensis(Pamp.) Rehder)是薔薇科蘋果屬植物[1]。該植物在我國分布廣泛且應用歷史悠久[2]。根據《中華草本》記載, 其嫩葉作茶葉應用已有400多年的歷史[3]。分布于華東、西南及山西、陜西、甘肅、河南、湖北、湖南、廣東等地[4]。已有眾多對湖北海棠的藥理作用進行了廣泛的研究，現已經通過實驗數據證實的藥理作用包括：降血糖、雌激素樣作用、保肝護肝、抗病原微生物[5，6]。研究表明，根皮苷及黃酮類成分是發揮藥理作用的主要藥效成分[7，8]。為進一步研究其藥效物質基礎,通過溶劑提取法、聚酰胺柱層析以及高效液相色譜等分離技術[9，10], 并通過現代波譜技術分析比對鑒定化合物的結構, 從70%乙醇提取物中分離與鑒定出11個化合物(圖1)，其中包含9個結構類型多樣的黃酮類化合物，本文將介紹這些化合物的分離與結構鑒定的詳細過程。

圖1 化合物1～11的化學結構式

2 儀器、試劑及藥材

由德國布魯克公司生產的核磁共振波譜儀(AVANCEIIITM, 500MHz), thermo半制備型色譜柱(250 nm×10 nm, 5 μm), 由上海貝茵科技有限公司生產的SHB-111A型循環水式多用真空泵, 由常州奧豪斯儀器有限公司生產的AX224ZH/E型電子天平, 由上海顧村電光科技有限公司生產的ZF-1型三用紫外分析儀, 由上海亞榮生化科技有限公司生產的RE2000A型旋轉蒸發儀, 由杭州瑞析科技有限公司生產的Waters半制備型高效液相色譜儀, 由青島海洋化工生產的柱色譜硅膠(200～300目)和聚酰胺粉(100-200目), 由上海國藥集團有限公司生產的甲酸、甲醇、乙醇(分析純) ,來自Sigma商城的甲醇(色譜純)和乙腈(色譜純, Sigma商城),由青島海洋化工生產的GF254型硅膠板。

湖北海棠采自湖北省宜昌市,由中南民族大學藥學院的熊慧博士鑒定為薔薇科蘋果屬(Malushupehensis(Pamp.) Rehder)的葉, 實驗剩余植物存放于中南民族大學藥學院。

3 提取與分離

干燥的湖北海棠葉稱取3 kg粉碎后用70%的乙醇室溫浸提3次, 分別浸提24 h, 12 h, 12 h, 將3次提取液抽濾，棄去濾渣,合并提取液, 用旋轉蒸發儀至用密度計測量后相對密度約為1.2, 約1500 mL, 加入3倍量約4500 mL的95%乙醇進行醇沉,室溫16 ℃靜置過夜抽濾得到上清液, 減壓濃縮至濃縮液沒有乙醇味即乙醇含量極少以便于進行下一步萃取,約1200 mL, 用等體積的乙酸乙酯萃取3次, 將乙酸乙酯層合并減壓濃縮得到浸膏300 g, 加入1500 mL超純水, 回流至固體全部溶解, 趁熱抽濾,棄去濾渣, 邊攪拌濾液邊等待濾液自然冷卻,靜置一晚后,所有液體混勻后用10 mL的EP管分裝,再分次用3000轉離心機離心10 min后棄去上清液, 得到的沉淀用甲醇溶解, 棄去的上清液合并后再靜置一晚重復離心步驟,合并溶解液得到1000 mL液體,減壓濃縮后得到110 g固體, 上聚酰胺柱(100～200目, 0.75 kg), 用30%乙醇洗脫, 通過薄層檢測, 合并相同部分得到5個組分(Fr.A～E).Fr.B上硅膠柱, 依次用二氯甲烷-甲醇為流動相梯度洗脫(95∶5,90∶10,80∶20,0∶1), 通過薄層檢測, 合并相同部分得到4個組分(Fr.B1-B4), Fr.B1經過半制備高效液相色譜(流動相∶乙腈∶0.1%甲酸水=4∶6)得到化合物11(5.3mg, tR= 20 min)、12(6mg, tR = 25 min); Fr.B2經過半制備高效液相色譜(流動相∶乙腈∶0.1%甲酸水=3∶7)得到化合物1(2.19g, tR = 31 min); Fr.B3經過半制備高效液相色譜(流動相∶乙腈∶0.1%甲酸水=3∶7)得到化合物2(300 mg, tR= 23 min), 3(7 mg, tR = 18 min), 4(2.8 mg, tR= 12 min),5(2.9 mg, tR= 22 min),6(6.6 mg, tR= 14 min), 7(7 mg, tR= 37.5 min); Fr.E經過半制備高效液相色譜(流動相∶乙腈∶0.1%甲酸水=35∶65)得到化合物8(5 mg, tR= 21 min),9(17 mg, tR= 10 min)。

4 結構鑒定

化合物1為白色粉末, 硫酸-香草醛顯黃色, 由NMR數據推出化合物的分子式為C21H24O10, 1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δH:7.06(1H, d, J = 8.5 Hz, H-2, 6), 6.69(2H, d, J = 8.5 Hz, H-3, 5), 6.18(1H, d, J = 2.5 Hz, H-3′), 5.96(1H, d, J = 2.0 Hz, H-5′), 5.04(1H, d, J = 7.0 Hz, H-1′′), 3.91(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6′′a), 3.72(1H,dd,J = 12.0,4.5 Hz,H-6′′b), 2.88(2H, t, J = 8.0 Hz, H-7)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1。

該波譜數據和文獻[11]比對后,基本一致, 最終鑒定該化合物為根皮苷。

化合物2為白色粉末,硫酸-香草醛顯黃色, 由NMR數據推出化合物的分子式為C21H24O11, 1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δH:6.70(1H, d,J = 2.0 Hz, H-2), 6.66(1H,d,J = 8.0 Hz,H-5), 6.56(1H,dd,J = 7.0, 2.0Hz, H-6), 6.18(1H,d,J = 2.0 Hz,H-3′), 5.96(1H,d,J = 2.0 Hz,H-5′), 5.04(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 4.00(1H, dd, J = 12.0 Hz, 2.0Hz, H-6′′a), 3.73(1H, dd, J = 12.0Hz, 5.0 Hz, H-6′′b), 2.88(2H,m,H-7).13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1。

該波譜數據和文獻[18]比對后,基本一致,最終鑒定該化合物為3-羥基根皮苷。

化合物3為黃色粉末, 硫酸-香草醛顯黃色, 根據圓二色譜結果, 二氫黃酮在300～340 nm處顯示負Cotton效應, 可推定C-2的絕對構型為S, 由NMR數據推出化合物的分子式為C21H22O10, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH: 5.36(1H, dd, J = 12.5, 3.0 Hz, H-2), 3.10(1H, dd, J = 16.5, 12.5 Hz, H-3a), 2.66(1H, dd, J = 16.5, 3.0 Hz, H-3b), 6.42(1H, d, J = 2.3 Hz, H-6), 6.12(1H, d, J = 2.3 Hz, H-8), 7.31(2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.81(2H, d, J = 8.5 Hz, H-3′, 5′), 4.83(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 3.92(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6′′a), 3.74(1H, dd, J = 12.0, 4.5 Hz, H-6′′b)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1。以上波譜數據與文獻[14]對照基本一致, 故鑒定化合物為2S-莖草素-5-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物4為黃色粉末, 硫酸-香草醛顯黃色, 根據圓二色譜結果, 二氫黃酮在300～340 nm處顯示負Cotton效應時，可推定C-2的絕對構型為S, 由NMR數據推出化合物的分子式為C21H22O11, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH: 5.29(1H, dd, J = 12.0, 2.5 Hz, H-2), 3.05(1H, dd, J = 15.5, 12.0 Hz,H-3a), 2.66(1H, dd, J = 16.0, 2.5 Hz, H-3b), 6.42(1H, d, J= 2.3 Hz, H-6), 6.12(1H, d, J = 2.3 Hz, H-8), 6.91(1H, s, H-2′), 6.78(2H, m, H-5′, 6′), 4.83(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1′′), 3.92(1H, dd, J = 11.0, 1.5 Hz, H-6′′a), 3.74(1H, dd, J = 13.5, 3.5 Hz, H-6′′b)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1。以上波譜數據與文獻[12]對照基本一致,故鑒定化合物為2S-柚皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物5為黃色粉末,硫酸-香草醛顯黃色,根據圓二色譜結果, 二氫黃酮在300～340 nm處顯示正Cotton效應時, 可推定C-2的絕對構型為R, 由NMR數據推出化合物的分子式為C21H22O10, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH: 5.33(1H, dd,J = 13.5, 3.0 Hz,H-2), 3.01(1H, dd, J = 17.5, 13.0 Hz,H-3a), 2.72(1H, dd, J = 17.0, 3.0 Hz, H-3b), 6.48(1H, d, J= 2.5 Hz, H-6), 6.14(1H, d, J = 2.5 Hz, H-8), 7.31(2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.81(2H, d, J = 8.5Hz, H-3′, 5′), 4.78(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 3.94(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6′′a), 3.76(1H, dd, J = 12.0, 5.0 Hz, H-6′′b)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1。以上波譜數據與文獻[12]對照基本一致,故鑒定化合物為2R-莖草素-5-O-β-D-葡葡萄糖苷。

化合物6為黃色粉末,硫酸-香草醛顯黃色,根據圓二色譜結果, 二氫黃酮在300～340 nm顯示正Cotton效應時, 可推定C-2的絕對構型為R, 由NMR數據推出化合物的分子式為C21H22O11, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH: 5.28(1H, dd,J = 13.0, 3.0 Hz,H-2), 2.96(1H, dd, J = 17.0, 12.5 Hz, H-3a), 2.71(1H, dd, J = 17.5, 3.0 Hz, H-3b), 6.48(1H, d, J= 2.5 Hz, H-6), 6.14(1H, d, J = 2.5 Hz, H-8), 6.91(1H,d, J = 1.0 Hz, H-2′), 6.78(2H, m, H-5′, 6′), 4.77(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1′′), 3.95(1H, dd, J = 12.5, 2.0 Hz, H-6′′a), 3.75(1H, dd, J = 12.0, 5.5 Hz, H-6′′b)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1。以上波譜數據與文獻[14]對照基本一致,故鑒定化合物為2R-柚皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物7為黃色粉末,硫酸-香草醛顯黃色,由NMR數據推出化合物的分子式為C21H20O10, 1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δH: 6.21(1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.38(1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 7.34(1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.91(1H,d, J = 8.5 Hz, H-5′), 7.32(1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6′), 5.35(1H, s, H-1′′), 0.94(3H, d, J = 6.0 Hz, H-6′′)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1。

該波譜數據與文獻[15～18]比對后,大體一致,最終鑒定此化合物為槲皮素-3-O-β-D-鼠李糖苷。

化合物8為黃色粉末,硫酸-香草醛顯黃色,由NMR數據推出化合物的分子式為C21H20O12, 1H-NMR(CD3OD,600 MHz)δH: 6.20(1H, d, J = 2.4 Hz, H-6), 6.40(1H, d, J = 2.4 Hz, H-8), 7.61(1H, d, J = 2.4 Hz, H-2′), 6.86(1H,d, J = 8.4 Hz, H-5′), 7.59(2H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz H-6′), 5.19(1H, d, J = 7.2 Hz H-1′′)。13C-NMR(CD3OD, 150 MHz)見表1。以上波譜數據與文獻[19～21]比對后,基本一致,最終鑒定此化合物為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷化合物 9為黃色粉末,硫酸-香草醛顯黃色,由NMR數據推出化合物的分子式為C21H20O11, 1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δH: 6.33(1H, s, H-5), 6.37(1H, s, H-7), 6.66(1H, s, H-10),7.49(2H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.84(1H,d, J = 8.5 Hz, H-5′), 7.21(2H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6′),5.02(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1, 本文為首次報道該化合物碳譜數據,并通過2D-NMR歸屬所有NMR的信號見圖2，故鑒定化合物為毛莨酢漿草苷[22，24～26]。

表1 化合物1-913C NMR數據

化合物10為黃色粉末, 硫酸-香草醛顯黃色, 由NMR數據推出化合物的分子式為C9H10O3,1H-NMR(CD3OD, 600 MHz)δH: 2.66(2H, t, J = 7.8 Hz, H-8), 2.80(2H, t, J = 7.8 Hz, H-7), 6.69(2H, d,J = 8.4 HzH-3, 5), 7.03(2H, d,J = 8.4 Hz, H-2, 6),該波譜數據與文獻[11]比對后,大體一致, 最終鑒定此化合物為對羥基苯丙酸。

化合物11為黃色粉末, 硫酸-香草醛顯黃色,由NMR數據推出化合物的分子式為C9H6O4, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH:7.91(1H, d, J = 6.0 Hz, H-2), 6.20(1H, d, J = 6.0 Hz, H-3), 6.21(1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.33(1H, d, J = 2.0 Hz, H-8),13C-NMR(CD3OD, 126 MHz)圖譜中顯示9個碳原子信號, δC:158.3(C-2), 111.8(C-3), 183.6(C-4), 163.6(C-5), 100.4(C-6), 166.4(C-7), 95.3(C-8), 160.1(C-9), 107.0(C-10)。以上波譜數據與文獻[13]對照基本一致, 故鑒定化合物為5,7-二羥基色原酮。

續表1

4 結語

通過對湖北海棠70%乙醇提取物的分離與純化,得到了11個化合物, 其中有9個為黃酮類化合物, 其結構分別鑒定為根皮苷(1)、3-羥基根皮苷(2)、2S-莖草素-5-O-β-D-葡萄糖苷(3)、2S-柚皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷(4)、2R-莖草素-5-O-β-D-葡萄糖苷(5)、2R-柚皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷(6)、槲皮素-3-O-β-D-鼠李糖苷(7)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(8)、毛莨酢漿草苷(9)、對羥基苯丙酸(10)、5, 7-二羥基色原酮(11), 9個黃酮類化合物,包括2個二氫查爾酮類,4個二氫黃酮醇類,2個黃酮醇類，1個橙酮類,且湖北海棠中未分離得到過橙酮類化合物,首次從湖北海棠這個植物中分離得到的化合物為化合物(7),化合物(8)和化合物(9),化合物(3)和(5)、(4)和(6)互為差向異構體, 該研究豐富了該植物化學成分的結構類型。