大口黑鱸β-防御素在桿狀病毒系統中的表達及抑菌活性

管翠翠 邱 礽,3 李潔瓊 蔣長軍 姚倫廣,3

(1.南陽師范學院生命科學與農業工程學院, 南陽 473061; 2.河南省畜禽保健品工程技術研究中心, 南陽 473061; 3.河南省伏牛山昆蟲生物重點實驗室和河南省昆蟲生物反應器工程實驗室, 南陽 473061)

抗菌肽(AMPs)是所有生物先天免疫系統的重要組成部分[1], 在免疫應答中通過直接殺傷或刺激免疫效應細胞, 從而發揮抗細菌、抗真菌、抗寄生蟲和抗癌等多種防御特性[2]。目前發現了魚類特有的抗菌肽: piscidin家族及防御素、cathelicidin、hepcidin家族[3]。防御素通常含有18—45個氨基酸和3—4個二硫鍵[4]。在哺乳動物中, 根據防御素的結構可以分為3個不同的亞家族(α-、β-和θ-防御素)[5]。魚類的防御素只有β-防御素樣蛋白[6], 含有6個保守的半胱氨酸, 可以形成Cys1-Cys5、Cys2-Cys4和Cys3-Cys6三對二硫鍵[7]。魚類防御素被證明具有多種功能, 包括抗菌、抗病毒和免疫調節活性等[8]。很多研究也表明, 重組或合成防御素能夠直接抑制革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌及一些病毒的生長[9,10]。

大口黑鱸(Micropterus salmoides)屬于鱸形目、太陽魚科, 黑鱸屬, 原產于美國加利福尼亞州,于1983年引入中國, 因其易養殖、生長迅速、肉質肥美、抗病能力強等優點被廣泛養殖。但近些年來人們發現, 在養殖大口黑鱸時, 其可能患上氣泡病、水霉病、爛鰓病、脂肪肝病及腸炎病等十幾種病, 急需采取措施改善這一現狀。由于防御素對細菌有很強的抑制作用而不易在細菌中高效表達,且其在原核系統中的表達具有不能正確折疊, 缺少翻譯后的修飾等缺點, 所以具有比較完備的基因表達調控機制和對真核基因表達產物的加工修飾能力的桿狀病毒表達系統成為一個較為理想的防御素基因表達系統, 并且由于p10和polh啟動子是晚期基因表達的強活性啟動子, 所以可以高效表達防御素基因。在本研究中, 我們通過分析大口黑鱸β-防御素基因(MSBdefe), 并通過桿狀病毒表達系統, 進行了MSBdefe重組蛋白表達及其抑菌功能的鑒定。本研究將為開發水產養殖藥物提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種與表達載體大腸桿菌E.coliTOP10菌株; 質粒pYBDM-IM是由本實驗室改造pFBDM所得, 缺失掉SpeⅠ酶切位點, 在SphⅠ位點和KpnⅠ位點之間插入核糖體結合位點的IRES 基因(簡寫為Ⅰ)和起報告基因作用的紅色熒光蛋白基因Mecherry(簡寫為M), 而其中的IRES有助于其紅色熒光蛋白的表達顯示; 菌株Ac MμLtiBac/rSW106/asd–/inv+,Sf9細胞、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)由本實驗室保存, 大口黑鱸購買自附近養殖場。

主要試劑KOD-Plus-Neo高保真酶購自TOYOBO公司, 限制性核酸內切酶購自NEB公司;提質粒和膠回收試劑盒購自OMEGA公司; ExTaq酶購自寶生物; 鎳親和層析介質、增強型DAB顯色試劑盒、抗生素購自Solarbio公司; pEASY-Blunt Zero Cloning Kit, Trans2K Plus DNA Marker, TOP10感受態細胞購自全式金; Biospin Virus DNA/RNA Extraction Kit 試劑盒購自BioFlux公司; T4 DNA Ligase、蛋白預染Marker、昆蟲細胞培養基Sf-900 ⅢSFM購自賽默飛; 6×His, His-Tag Mouse Monoclonal antibody、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)購自Proteintech Group公司。

1.2 方法

MSBdefe的序列分析通過本實驗室構建的大口黑鱸基因組文庫, 發現一個核酸序列同之前報道的大口黑鱸β-防御素基因(GenBank: XP0385 64716)完全一致。通過DNAMAN對大口黑鱸β-防御素(MSBdefe)與GenBank中的部分硬骨魚類: 歐洲鱸(QZN83614)、條石鯛(AJA33388)、鱖(ACO88907)、大西洋白姑魚(ASW20415)、長棘銀鱸(QNV47918)、馬拉巴若鲹(QJW82620)、點帶石斑魚(AFA41485)、鯔(QOS14209)、卵形鯧鲹(AWY04221)、泰國鱧(QJW82621)、小鼠(AAT67592)及人類(NP001035792)的β-防御素進行同源性比對。

MSBdefe的克隆與載體構建根據昆蟲密碼子偏愛性, 對MSBdefe基因進行密碼子優化后, 由蘇州鴻訊生物科技有限公司合成, 序列克隆5′端引入SmaI酶切位點(CCCGGG)和Flag標簽(DYKDDDDK), 3′端引入XhoⅠ酶切位點, 酶切位點前添加8個His標簽和終止密碼子(TAA), 以保證目的基因的檢測和純化。添加標簽后, 表達基因序列長度達到345 bp。目的基因插入pUC57載體中, 得到pUC-MSBdefe質粒。MSBdefe區域檢測引物用Primer Premier5.0軟件分析設計, 只針對目的片段其中305 bp進行擴增, 設計的引物送上海生物工程技術服務有限公司合成, 上游引物MSBdefeJCF:ATGGATTACAAGGATGACGAC, 下游引物MSBdefeJCR: CAGCAGAATGCCCAGAGTC。

構建重組轉移載體用SmaⅠ/XhoⅠ限制性內切酶雙酶切pUC-MSBdefe上的目的基因, 將其與經SmaⅠ/XhoⅠ限制性內切酶雙酶切的供體載體pYBDM-IM按1﹕7(摩爾比)混合, 在T4 DNA連接酶作用下4℃孵育過夜后, 轉入大腸桿菌TOP10感受態細胞。經菌落PCR和SmaⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定,將鑒定正確的陽性質粒命名為MSBdefe-pYBDM-IM。

重組Bacmid菌株的獲得將5 μL重組轉移質粒MSBdefe-pYBDM-IM加到100 μL大腸桿菌感受態Ac MultiBac/rSW106/asd–/inv+中, 冰浴30min,待冰浴時間到后迅速在42℃水浴鍋中熱激90s, 待熱激結束, 將感受態轉移至冰上, 孵育3min后加入1 mL含有DAP的LB培養基, 32℃, 200 r/min, 振蕩培養5—6h。離心后將適量菌液涂布于含有DAP/Kan/Tet/Spe/IPTG/X-Gal/Gm的LB篩選平板, 32℃培養48h,直至出現藍白斑, 挑取白斑菌落用特異性引物MSBdefeJCF, MSBdefeJCR進行菌落PCR鑒定, 將鑒定正確的陽性Bacmid菌落命名為MSBdefe-pYBDMIM-Am。

重組桿狀病毒的構建將構建好的Bacmid菌液感染Sf9細胞, 具體過程為: 取1 mLMSBdefepYBDM-IM-Am菌液于1.5 mL滅菌管中, 5000 r/min離心3min收集菌體并棄上清。用1 mL無菌水重懸菌體, 5000 r/min離心3min收集菌體并棄上清, 重復洗4—5次。加入1 mL Sf-900 Ⅲ SFM培養基重懸, 此時菌液濃度記為100。按1﹕10倍梯度稀釋, 將菌液濃度稀釋成10–1、10–2和10–3。將稀釋后的菌液依次加入培養有Sf9細胞的24孔板中, 每孔500 μL。28℃孵育4h后棄去上清, 用培養基清洗3次后每孔加入500 μL培養基, 28℃孵育3—5d, 在倒置熒光顯微鏡下觀察是否有紅色熒光出現, 判斷桿狀病毒是否重組成功。收集200 μL感染重組病毒的Sf9細胞培養基上清, 使用BioFlux公司Biospin Virus DNA/RNA Extraction Kit試劑盒提取重組桿狀病毒DNA。以重組桿狀病毒DNA為模板, 用MSBdefe基因的檢測引物MSBdefeJCF, MSBdefeJCR進行PCR鑒定, 重組病毒命名為AV-MSBdefe。

重組蛋白表達及鑒定收集200 mLAV-MSBdefe感染的Sf9細胞, 3000 r/min離心去掉細胞培養基后用PBS清洗1—2次, 加適量PBS重懸, 在冰上進行超聲破碎直至溶液透亮。3000 r/min離心10min獲得上清, 將上清經0.45 μm濾膜過濾后, 用帶有His標簽的Ni柱進行純化, 純化蛋白凍于–80℃保存,以備檢測。蛋白進行SDS-PAGE電泳后, 轉移到PVDF膜上, 脫脂奶粉封閉1h后, 分別用抗His的鼠單克隆抗體為一抗, HRP標記的山羊抗小鼠IgG為二抗各孵育1h, 用最新配置的DAB顯色試劑進行顯色。

重組蛋白體外抑菌活性檢測采用平板涂布法檢測MSBdefe重組蛋白抑菌活性。具體過程為: 將嗜水氣單胞菌接種于LB液體培養基中,28℃、200 r/min培養12h, 至A600為1.0, 菌液梯度稀釋至1×104CFU/mL。分別添加終濃度為30、15 和7.5 μg/mL的MSBdefe重組蛋白, 每個濃度做3個重復, 28℃培養2h后, 取100 μL涂于無抗固體LB平板上, 陰性對照為PBS處理組, 同樣做3個重復, 28℃過夜培養后觀察菌落生長情況并進行菌落計數, 并使用GraphPad Prism 9軟件進行分析。

式中,A1為實驗組的菌落數,A2為陰性對照組的菌落數。

2 結果

2.1 同源序列分析

MSBdefe基因編碼63個氨基酸殘疾, BLAST分析表明,MSBdefe與一些硬骨魚的β-防御素的序列同源性可以達到92.06%—98.41%。和歐洲鱸(Dicentrarchus labrax)、條石鯛(Oplegnathus fasciatus)、鱖(Siniperca chuatsi)、大西洋白姑魚(Argyrosomus regius)、長棘銀鱸(Gerres filamentosus)、馬拉巴若鲹(Carangoides malabaricus)、點帶石斑魚(Epinephelus coioides)、鯔(Mugil cephalus)、卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)和泰國鱧(Channa striata)的同源性分別達到98.41%、96.83%、96.83%、95.31%、95.24%、93.65%、93.65%、92.54%、92.06%和92.06%。同人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的同源性分別達到30.67%和26.03%。序列比對同時顯示MSBdefe的6個半胱氨酸同其他高等和低等脊椎動物中都是保守的。

2.2 克隆載體MSBdefe-bluntzero的合成

針對MSBdefe基因進行昆蟲桿狀病毒系統表達, 采用同義置換進行昆蟲氨基酸密碼子優化, 對MSBdefe進行基因合成, 并在該氨基酸的N端加Flag標簽序列DYKDDDDK, C端加8個His標簽, 合成的質粒pUC-MSBdefe包含345個核苷酸, 理論分子量為12.2 kD。序列如下: CCCGGGATGGATT ACAAGGATGACGACGATAAGAGGACCCTCGC CATCCTTGCTGCCATTCTCCTGGTGGCCCT GCAGGCCCAGGCTGAGCCACTCCAGGCAA GAGCTGATGAGGTTGCTGCAGCCCCGGAG CAGATTGCAGCGGACATCCCAGAAGTGGT TGTTTCCCTTGCATGGGACGAAAGCTTGGC TCCAAAGCATCCAGGCTCAAGGAAAAACAT GGCCTGCTATTGCAGAATACCAGCGTGCAT TGCAGGAGAACGTCGCTATGGAACCTGCATC TACCAGGGAAGACTCTGGGCATTCTGCTGC CACCACCACCACCACCACCACCACTAACTC GAG。

2.3 轉移載體及重組菌株的構建

對合成的質粒pUC-MSBdefe進行SmaⅠ/XhoⅠ酶切, 同轉移質粒pYBDM-IM進行連接, 獲得重組質粒MSBdefe-pYBDM-IM, 進行SmaⅠ/XhoⅠ酶切鑒定, 切出345 bp的目的條帶, 和預計分子量一致,這些結果表明轉移質粒MSBdefe-pYBDM-IM構建成功。轉移質粒MSBdefe-pYBDM-IM轉化Ac MultiBac/rSW106/asd–/inv+感受態細胞后, 進行菌落PCR鑒定, 電泳結果顯示擴增得到305 bp左右的片段, 得到重組菌株MSBdefe-pYBDM-IM-Am。

2.4 桿狀病毒的重組及檢測結果

將重組菌株MSBdefe-pYBDM-IM-Am直接感染Sf9細胞, 3d后倒置熒光顯微鏡下觀察到有明顯紅色熒光的細胞, 細胞低速離心后, 收集上清, 獲得病毒, 進行多代感染, 3d后細胞出現紅色熒光, 表明獲得了重組桿狀病毒(圖1)。提取重組桿狀病毒基因組, 以MSBdefeJCF和MSBdefeJCR為引物, 進行PCR鑒定, 可擴增出305 bp左右的目的條帶, 與理論值一致, 說明獲得了含有MSBdefe基因的重組桿狀病毒AV-MSBdefe。

圖1 熒光顯微鏡觀察重組桿狀病毒感染Sf9細胞Fig.1 Microscopy observation of infected Sf9 cells by recombinant virus

2.5 重組蛋白純化及Western鑒定結果

收集感染AV-MSBdefe的Sf9細胞, 在超聲波破碎后, 進行SDS-PAGE電泳, 考馬斯亮藍染色, 可觀察到約在相對分子質量12.2 kD處有明顯可見的條帶, 用帶有His標簽的Ni柱進行親和層析, 獲得12.2 kD的純化蛋白, 進一步通過Western Blot驗證, 表達蛋白可以同抗His的小鼠抗體進行結合(圖2), 說明重組蛋白得到了特異性表達。

圖2 MSBdefe蛋白Western Blot鑒定結果Fig.2 Western Blot of MSBdefe protein

2.6 MSBdefe重組蛋白抑菌活性檢測

如圖3所示, 與陰性對照PBS相比, 嗜水氣單胞菌與重組蛋白作用后, 平板上的菌落數明顯減少(圖3a)。通過GraphPad Prism 9軟件分析顯示終濃度為30 μg/mL的MSBdefe重組蛋白對嗜水氣單胞菌具有顯著的抑菌作用, 細菌存活率為17.00%, 抑菌效率為83.00%。并隨著梯度稀釋2倍和4倍后, 即終濃度為15 和7.5 μg/mL時, 抑菌效果逐漸減弱, 抑菌效率分別為54.33%和33.67%(圖3b)。這證明MSBdefe重組蛋白具有較好的抑菌活性。

圖3 不同濃度重組蛋白體外抑菌分析結果Fig.3 In vitro antibacterial analysis results of MSBdefe protein at different concentrations

3 討論

近年來, 隨著病原體耐藥性的增加, 人們對后抗生素時代的擔憂迫使人們需要找到現有抗生素的替代品。β-防御素是一類富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽, 具有廣譜活性、反應時間快、耐藥水平低和對宿主毒性最小等優點, 通過對入侵病原體的抗菌活性在天然免疫系統中發揮重要作用, 具有廣闊的應用前景。如何通過基因工程手段進行防御素的大批量生產至關重要。大腸桿菌原核表達系統的外源蛋白質表達有其局限性, 例如對新生肽鏈無翻譯后加工能力、以致表達產物缺乏應有的生物學活性, 故不適合作為真核基因表達的宿主[11]。真核酵母表達系統經過多年發展已經具備了成熟的發酵工藝, 來提高產量, 但酵母表達系統依然存在短板, 大多數重組蛋白表達量低, 而且可能會出現切割目的蛋白的情況出現, 并且存在過度糖基化的問題。而桿狀病毒表達系統的宿主主要是以昆蟲細胞為主, 因為昆蟲細胞具有類似哺乳動物的翻譯后加工修飾的能力, 能夠正確折疊并表達蛋白,具有糖基化、磷酸化和酰胺化等翻譯后修飾功能,并能夠對信號肽進行識別, 使其形成正確的高級結構, 保留其生物活性, 與哺乳動物細胞內的差別很小。這些修飾對于所表達產物在生物活性、抗原性和免疫都接近于天然產物。并且由于多角體強啟動子polh和p10的存在, 能夠獲得高水平的重組蛋白表達, 目標蛋白表達量可達到總蛋白的50%[12,13]。

在魚類中, β-防御素首先在紅鰭東方鲀 (Takifugu rubripes)、斑點綠色河鲀(Tetraodon nigroviridis)和斑馬魚(Danio rerio)中發現[14]。作為AMPs的典型成員, β-防御素具有直接的抗菌活性。在本研究中, 我們對MSBdede進行了序列分析比對工作,發現MSBdede和其他物種的β-防御素有著相似的結構, 都含有6個保守的半胱氨酸殘基, 這些半胱氨酸殘基參與了成熟肽區域內的三個分子二硫鍵, 這是防御素的主要特征。這些二硫鍵在維持防御素結果和抗菌功能方面起著重要作用[15]。本研究將MSBdefe克隆到轉移載體pYBDM-IM上, 通過Tn7位點轉座到Bacmid基因組中, 由多角體啟動子p10啟動,從而在Sf9細胞中大量表達MSBdefe重組蛋白。Tn7位點的轉座為零背景轉座, 大大提高了轉化效率, 該系統利用缺失asd型的rSw106inv菌株可以通過直接感染Sf9細胞的方式進行重組病毒的構建,省去了大質粒提取和用轉染試劑轉染質粒的麻煩,具有更高效率和經濟價值。最終利用獲得的重組Bacmid菌株MSBdefe-pYBDM-IM-Am, 通過多輪感染, 在培養基中獲得高滴度的重組昆蟲桿狀病毒AV-MSBdefe。Western Blot結果顯示感染了AVMSBdefe重組病毒的Sf9細胞內表達了帶有His標簽的MSBdede蛋白。這說明利用昆蟲桿狀病毒表達系統成功表達了MSBdede蛋白。

之前在魚類中已經有一些β-防御素抗菌功能研究成果, 且不同魚類β-防御素的抑菌譜存在差異。例如: 利用真核哺乳細胞表達的金頭鯛β-防御素重組蛋白對鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)表現出較強的抑菌活性, 而對美人魚發光桿菌(Photobacterium damselae)和哈維氏弧菌(Vibrio harvey)等其他魚類病原體表現出較弱的抑菌活性[16]; 化學方法合成的香魚β-防御素蛋白對嗜水氣單胞菌具有較強的直接抑菌活性, 而對鰻弧菌等其他6種細菌的抑菌活性較弱[17]。對鱖β-防御素進行多拷貝基因的酵母重組表達, 重組蛋白對革蘭氏陰性菌的副溶血性弧菌抑菌作用顯著[18]。構建斑點叉尾鮰β-防御素的重組表達酵母菌株, 其重組菌株具有明顯抑制革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌及革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌的活性[19]。在之前的研究中, 還發現不同魚類β-防御素抑菌濃度存在差異。例如: 從文昌魚(Branchiostoma japonicum)中克隆大防御素基因(Bjbd), 并利用原核表達對其抗菌活性進行研究, 研究表明在62.5 μg/mL濃度下, 對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)生長均有顯著抑制作用[20]; 通過同源克隆技術從草魚的腦、肝及部分黏液組織中克隆β-防御素基因, 在原核表達系統中表達蛋白并研究其抑菌活性。抑菌結果表明重組蛋白在1 μg/μL濃度下對嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的抑菌效率在90%以上[21];原核重組斑馬貽貝(Dreissena polymorpha)的防御素蛋白對部分革蘭氏陰性菌如摩根菌(Morganellasp.)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)、遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌活性較強, 其MIC分別為0.35、0.43、1.16、6.46和30.39 μmol/L, 但對其他一些革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑菌作用較弱[22]。原核重組石斑魚(Epinephelus coioides)的β-defensin蛋白對8株細菌進行了抗菌分析, 其中包括5株革蘭氏陰性菌: 大腸桿菌(Escherichia coli)、河弧菌(Vibrio fluvialis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)和3株革蘭氏陽性菌株: 蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和藤黃微球菌(Micrococcus luteus)。結果顯示, 重組石斑魚β-defensin蛋白濃度達512 μg/mL時, 8株菌的存活率均低于10%[9]。 我們選擇淡水魚類最常見的病原菌嗜水氣單胞菌為指示菌, 研究了大口黑鱸β-defensin真核重組蛋白的抑菌活性, 結果表明, 當MSBdefe重組蛋白的終濃度為30 μg/mL時, 抑菌效率達到83.00%, 證明大口黑鱸β-defensin真核重組蛋白有明顯的抑菌活性。這說明不同來源的魚類抗菌肽有著不同的抑菌功能, 且抑菌活力也有較大差異。

總之, 在本研究中, 構建了基于桿狀病毒表達系統的MSBdede表達菌株, 并通過零背景轉座, 高效獲得含有MSBdede的重組桿狀病毒, 感染Sf9細胞進而表達了MSBdede重組蛋白, 體外抑菌活性實驗檢測出MSBdefe重組蛋白對嗜水氣單胞菌活性有較強的抑制作用。為利用昆蟲生物反應器規模化生產魚類β-防御素奠定了基礎。