鴨肉中硝呋烯腙殘留檢測提取方法探究

湯 優(yōu) 福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心 福州 350003

硝呋烯腙（Nitrovin，化學(xué)式C14H12N6O6）屬于硝基呋喃類化合物的一種，是20世紀(jì)70年代中期發(fā)現(xiàn)的一種新型抗生素，能夠促進(jìn)動(dòng)物生長。其作用機(jī)理是增強(qiáng)動(dòng)物腸道黏膜的通透性，使進(jìn)入動(dòng)物消化道中的營養(yǎng)物質(zhì)在消化和吸收等方面得到有效提高；同時(shí)，動(dòng)物消化道中一些病原微生物對葡萄糖的利用受抑制，阻礙了其新陳代謝而受到抑制和殺滅，從而減少了動(dòng)物疾病感染的機(jī)會(huì)[1]，可在豬、雞、鴨等動(dòng)物養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用[2]。但目前因廣泛使用抗生素所帶來的耐藥、殘留和二重感染等問題已日益凸顯、嚴(yán)重，已成為人類需要面臨的重大挑戰(zhàn)[3]。根據(jù)國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號(hào)公告：嚴(yán)禁硝呋烯腙用于食品動(dòng)物養(yǎng)殖。食品動(dòng)物硝呋烯腙殘留檢測已成為監(jiān)測我國食品動(dòng)物肉類安全的有效且重要的手段之一。目前，國內(nèi)關(guān)于硝呋腙殘留檢測的研究文獻(xiàn)較少，只有少量的用高效液相色譜法檢測[4]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測[5-8]等報(bào)道。本文對鴨肌肉基質(zhì)中硝呋烯腙殘留物檢測前處理的不同提取方法進(jìn)行比較、探索，確定經(jīng)0.1%三氯乙酸水提取，提取液經(jīng)乙腈鹽析，正己烷液液分配去脂，基質(zhì)固相分散凈化后用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定量檢測，不僅能有效排除雜質(zhì)干擾，而且快速、簡便、準(zhǔn)確，可用于鴨肉中硝呋烯腙殘留量的測定。

1 材料與方法

1.1 儀器 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（型號(hào)：TQS MS/MS，美國沃特世公司）；電子天平（型號(hào)：AX105，瑞士梅特勒-托利多公司）；高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：D-37520，美國科俊公司）。

1.2 試劑 硝呋烯腙（含量不低于97.0%），硝呋烯腙內(nèi)標(biāo)（C13-硝呋烯腙，含量不低于97.0%）；N,N-二甲基甲酰胺（C3H7NO）、三氯乙酸、氯化鈉，均為分析純；甲醇、甲酸、乙腈和正己烷，均為色譜純；超純水。

1.2.1 硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（100 mg/L）的配制利用電子天平精密稱取10 μg硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL燒杯中，用2 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，再用0.1%甲酸-甲醇稀釋后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，配成100 mg/L硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)貯備液。使用時(shí)取適量，用甲醇稀釋至合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，應(yīng)注意現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 硝呋烯腙內(nèi)標(biāo)工作液（100 mg/L）的配制 利用電子天平精密稱取10 μg硝呋烯腙內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL燒杯中，加2 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，再用0.1%甲酸-甲醇稀釋并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，配成100 mg/L硝呋烯內(nèi)標(biāo)腙標(biāo)準(zhǔn)貯備液。使用時(shí)，采用甲醇稀釋，配制成濃度為0.10 mg/L硝呋烯腙內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 硝呋烯腙工作曲線測定溶液配制 取一定量硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)工作液和C13-硝呋烯腙內(nèi)標(biāo)工作液，用50%乙腈水溶液稀釋，硝呋烯腙稀釋成2.0、5.0、10、20、50、80 μg/L系列濃度，C13-硝呋烯腙濃度為10.0 μg/L硝呋烯腙系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件 規(guī)格型號(hào)為BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）的色譜柱，采用35℃柱溫，0.3 mL/min的流速。其中，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫程序?yàn)?～4.0 min，采用90%A和10%B；4.1～7.0 min，采用2%A和98%B；采用7.1～10.0 min，90%A和10%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子源模式 電噴霧正離子源模式（ESI+），定性離子對、定量離子對及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見表1。

表1 硝呋烯腙的定性、定量離子對及錐孔電壓、碰撞能量參考值

1.4 樣品處理方法 取鴨肌肉部分5.00 g（精確至±0.01 g）于50 mL離心管中，加入硝呋烯腙內(nèi)標(biāo)工作液100 μL和0.1%三氯乙酸水溶液10 mL，2 000 r/min勻漿提取2 min后，加入20 mL乙腈，旋渦混勻。之后加入2.0 g氯化鈉，旋渦混勻后8 000 r/min離心5 min；取上層清液于45℃水浴氮?dú)獯蹈桑?.00 mL乙腈溶劑溶解殘?jiān)尤?0 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋2 min后8 000 r/min離心2 min；棄去正己烷層后，加入PSA 80 mg，渦旋30 s，取上清液過膜至1.5 mL試管中。量取濾液0.5 mL于離心管中，45℃水浴氮?dú)獯蹈桑尤?0%乙腈水溶液0.5 mL，渦旋30 s，過有機(jī)濾膜（0.22 μm），用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.5 樣品前處理提取條件 考察實(shí)驗(yàn)室常用有機(jī)溶劑乙腈在不同條件下對肉鴨肌肉中硝呋烯腙的提取效率。（1）在中性pH體系下，選用去離子水環(huán)境體系和乙酸鈉緩沖液體系（pH 7.7），分別用乙腈進(jìn)行提取。（2）在酸性體系中，選取三種實(shí)驗(yàn)室常用的鹽酸、甲酸和三氯乙酸作為酸性溶液考察提取效率。（3）選用酸性濃度為0.1%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈、0.1%三氯乙酸乙腈分別進(jìn)行提取，考察不同酸性濃度對提取效率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理提取條件的確定 試驗(yàn)結(jié)果見圖1。去離子水環(huán)境下，乙腈對鴨肌肉中硝呋烯腙的提取效率不到40%，乙酸鈉緩沖液體系下為59.1%；均低于純乙腈提取效率59.7%；說明去離子水和緩沖液體系的加入降低了乙腈對硝呋烯腙的提取效率。在酸性體系下，乙腈在1%三氯乙酸體系中對鴨肌肉中硝呋烯腙的提取效率為64.2%；1%甲酸體系下，提取效率為77.2%；鹽酸水解條件下，提取效率為13.7%。可見，酸性體系下，乙腈對肉鴨肌肉中硝呋烯腙的提取效率明顯提高，但鹽酸水解無法提高其提取效率；在不同的甲酸水和三氯乙酸水濃度下，0.1%三氯乙酸水濃度下乙腈的提取效率最高，為92.9%，高于甲酸體系。考慮成本、環(huán)保等因素，選擇0.1%三氯乙酸溶液和乙腈作為提取溶劑。

圖1 不同前處理方法比較

2.2 線性關(guān)系的考察 準(zhǔn)確量取硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)工作液和C13-硝呋烯腙內(nèi)標(biāo)工作液，用50%乙腈水溶液將硝呋烯腙稀釋至2.0、5.0、10、20、50、80 μg/L不同濃度，將C13-硝呋烯腙內(nèi)標(biāo)工作液稀釋至10.0 μg/L，用于硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)曲線測定。線性結(jié)果為Y=0.124730X+0.0582651，相關(guān)系數(shù)R2=0.997941（見圖2）。

圖2 硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 添加回收與精密度 為考察方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，研究過程中以空白的肉鴨肌肉為對象，配制三個(gè)濃度試樣，分別為1 μg/kg、2 μg/kg、10 μg/kg，每個(gè)濃度水平做6次平行試驗(yàn)，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。結(jié)果見表2、圖3-圖4。

圖3 鴨肌肉基質(zhì)中1.0 μg/kg加標(biāo)水平色譜圖

圖4 鴨肌肉基質(zhì)空白樣品色譜圖

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié) 論

本文對鴨肉中硝呋烯腙殘留檢測前處理方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，使硝呋烯腙藥物的提取效率得到提高，回收率和色譜峰形均得到改善。用該方法檢測鴨肌肉中硝呋烯腙殘留，目標(biāo)化合物與雜質(zhì)的分離效果好，同時(shí)準(zhǔn)確度與靈敏度高，是一種有很強(qiáng)可行性和實(shí)用性的方法。