一例番鴨呼腸孤病毒與鴨疫里默氏菌共感染的實驗室診斷

謝碧林 林志敏 林彬彬 翁漢東 莆田市農業科學研究所 福建莆田 351100

隨著番鴨養殖行業不斷發展壯大，水禽疫病也呈現出日益復雜的態勢。番鴨呼腸孤病毒病的主要特征是軟腳，剖檢見肝臟和脾臟出現小白點，腎臟腫大、出血，俗稱番鴨“肝白點病”、“花肝病”[1-2]。鴨傳染性漿膜炎是由鴨疫里默氏菌引起的一種接觸性傳染性疾病，感染鴨有明顯的纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎和腦膜炎等病變[3]。

2021年11月，本所實驗室接診一例來自莆田市荔城區某雛番鴨養殖戶的病例。該養殖戶共有4個鴨舍，存欄6 000多羽雛番鴨，采用雙層網上平養養殖模式。22日齡時，其中1個鴨舍開始發病，每日約有40羽死亡，患鴨精神萎靡，食欲不振，腿軟不愿意走動，部分鴨出現站立不穩，頭歪轉圈等共濟失調癥狀。鴨舍通風不良，氨味濃。剖檢病死鴨，可見心臟布滿白色纖維素滲出物，脾臟有大量白色點狀壞死，胰腺表面散布白色壞死點，腎臟腫大。根據臨床癥狀、剖檢病變及實驗室分離檢測結果，確診為番鴨呼腸孤病毒與鴨疫里默氏菌共感染病例。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料組織 病料無菌采自莆田市荔城區某雛番鴨養殖戶疑似感染番鴨呼腸孤病毒與鴨疫里默氏菌的22日齡病死番鴨的肝臟、脾臟、胰腺、腎臟和腦等病變組織。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB）、麥康凱瓊脂、藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、GeneRed核酸染料，購自天根生化科技有限公司；第一鏈cDNA合成Master Mix、柱式病毒RNA抽提純化試劑盒、Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒，購自生工生物工程有限公司。

1.1.3 引物設計與合成 參照文獻[4-10]合成鴨疫里默氏菌外膜蛋白A基因（OmpA）引物及番鴨呼腸孤病毒、鴨甲肝病毒、番鴨細小病毒、小鵝瘟病毒、鴨瘟病毒、新型鴨呼腸孤病毒、鴨腺病毒2型、鴨腺病毒3型等病毒檢測引物。鴨疫里默氏菌外膜蛋白A基因（OmpA）及番鴨呼腸孤病毒檢測引物見表1，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 部分檢測引物序列及相關參數

1.2 方法

1.2.1 細菌分離鑒定

1.2.1.1 細菌的分離純化 無菌挑取病死番鴨腦組織，分別劃線接種至麥康凱瓊脂培養基及加入2%胎牛血清的TSA培養基，TSA培養基平板放入燭缸，與麥康凱培養基一起置于37℃溫箱中培養24～48 h。

1.2.1.2 細菌PCR檢測 挑取純培養菌落于50 μL ddH2O中，吹打混勻，沸水浴5 min，自然冷卻后5 000 r/min離心5 min，取上清作為模板進行PCR檢測，同時以ddH2O作為空白對照。PCR反應體系20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 8 μL。PCR擴增程序：96℃預 變 性5 min，94℃變 性1 min，60℃退 火50 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果在NCBI網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行Blast分析。

1.2.1.3 細菌藥敏試驗 根據抗微生物藥物敏感性試驗執行標準（CLSI）的要求，通過紙片擴散法對分離菌株進行抗菌藥物的藥敏試驗。

1.2.2 常見病毒PCR檢測 取適量病死番鴨病變組織，加入4倍量滅菌生理鹽水研磨、勻漿，反復凍融3次，離心取上清，按照試劑盒說明書的要求提取病毒核酸，DNA存-20℃，RNA反轉錄后存-20℃備用。分別對上述樣品按照文獻[5-10]對疑似疫病病原（鴨甲肝病毒、番鴨細小病毒、小鵝瘟病毒、番鴨呼腸孤病毒、新型鴨呼腸孤病毒、鴨瘟病毒、鴨腺病毒2型和3型）開展（RT-）PCR檢測，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果在NCBI網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行Blast分析。

2 結 果

2.1 細菌的分離鑒定

2.1.1 細菌分離結果 病死番鴨腦組織病料經細菌純化培養，在麥康凱瓊脂平板上未見細菌生長；在TSA平板上可見直徑約1.5 mm、表面光滑、圓形稍隆起、邊緣整齊的菌落，斜射光觀察可見菌落呈淡藍色，挑取典型單菌落進行純培養。

2.1.2 細菌PCR檢測結果PCR擴增得到的片段大小為809 bp，與預期結果一致（見圖1）。將PCR產物送生物公司測序，測序結果在NCBI上Blast分析，結果顯示，與鴨疫里默氏菌OmpA基因序列的同源性為100%。

圖1 細菌、病毒PCR擴增檢測情況

2.1.3 細菌藥敏試驗結果 藥敏試驗結果顯示（見表2），該鴨疫里默氏菌分離株對氨芐西林、阿莫西林、頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢吡肟、四環素、強力霉素、環丙沙星、氟苯尼考等藥物高度敏感；對青霉素G、恩諾沙星中度敏感；對鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、新霉素、紅霉素、復方新諾明、多粘菌素等藥物耐藥。

表2 鴨疫里默氏菌藥敏試驗結果

2.2 病毒PCR檢測結果 病毒PCR擴增顯示，只有番鴨呼腸孤病毒擴增得到300 bp目的條帶，其他病毒檢測均未擴增出目的條帶（見圖1）。將以上PCR產物送生物公司測序后進行堿基序列比對，結果顯示送檢的PCR產物樣品基因序列與GenBank中鴨呼腸孤病毒HP080421株的S2基因序列（登錄號為JX852431.1）同源性為98%。

3 結論與討論

結合發病番鴨的臨床癥狀、剖檢情況和實驗室病原檢測結果，確定該病例為番鴨呼腸孤病毒與鴨疫里默氏菌共感染。

番鴨呼腸孤病毒病是由番鴨呼腸孤病毒引起的，國內胡奇林等[11]于2000年首次報道，隨后吳寶成等[1]分離出該病毒，并鑒定為呼腸孤病毒。該病的主要病理表現為肝、脾表面分布有大量白點，腎臟出血、腫大。番鴨呼腸孤病毒感染通常有脾臟受損的現象，易引起其功能失常而致免疫抑制[12]，進而易繼發大腸桿菌病[13]或鴨疫里默氏菌病[14]等細菌病。鴨疫里默氏菌是當前危害番鴨養殖的重要細菌病原之一，給番鴨養殖行業造成巨大的經濟損失。

當前，番鴨養殖面臨著復雜的生存環境，動物疫病對番鴨養殖業的危害越來越突出，診療的費用提升了番鴨的養殖成本。因此，減少診療的支出將是提高養殖利潤的途徑之一。在當前限抗和無抗養殖的背景下，動物疫病防控應當遵循“預防為主，防重于治”的方針，養殖戶須積極主動做好疫苗防疫規劃工作，化被動為主動，提高番鴨自身抵抗病原菌侵染的能力。

疫苗仍然是防控疫病的首選。據了解，莆田地區的孵化場，出雛當日均為其注射了番鴨呼腸孤病毒病疫苗，為該病的預防提供了一定的基礎，現暫未發現該病大規模流行。

為提升動物疫病診斷準確性，對分離的細菌應進行血清分型和藥物敏感性試驗，做到有的放矢，避免因使用對病原不敏感的藥物而造成浪費。在疫病防控過程中，生物安全措施發揮著重要的作用，而部分養殖業主特別是散養戶觀念相對落后，對番鴨養殖環境的生物安全措施重視程度不夠，因此造成慘痛的經濟損失。動物疫病診療從業者應積極引導，普及更新養殖業主的專業知識，提升動物福利。