3種甘薯病毒多重PCR檢測方法的建立與應用

李文宗,梁 鑫,楊露露,王潤豪,王 磊

(1.河南華智營養科技有限公司，河南新鄉 453000；2.中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081)

甘薯病毒病是甘薯的重要病害，具有種類繁多、分布廣泛、容易傳播、危害嚴重、防控困難等特點。甘薯是無性繁殖作物，在感染病毒后，在甘薯體內病毒會不斷積累，逐代加重，進而引起甘薯產量和品質的下降以及種性的退化，嚴重損害甘薯產業的健康發展[1]，是目前限制甘薯生產的主要因素之一。已知侵染甘薯的病毒有30余種[2-3]。甘薯卷葉病毒(sweet potato leaf curl virus，SPLCV)、甘薯羽狀斑駁病毒(sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)、甘薯褪綠矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV)是3種嚴重危害甘薯的病毒，在世界甘薯種植區廣泛分布[4-6]。其中，SPLCV為單鏈環狀DNA病毒，基因組大小約2.8 kb，是雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬成員[7]；SPFMV為正義單鏈RNA病毒，基因組大小約10 kb，是馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒屬成員;SPCSV為雙組份正義單鏈RNA病毒，基因組大小約15.3～16.0 kb，是長線形病毒科毛行病毒屬成員[8]。不同品種甘薯植株在遭受SPLCV病毒侵染后，會表現出不同程度的致病癥狀，如葉片向上卷曲、黃化等，此外其葉綠素含量指數、葉面積、葉片鮮重均有所降低[9]。SPFMV和SPCSV可以協生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害(sweet potato virus disease，SPVD)[10]，甘薯植株在單獨受到SFMV或SPCSV后的癥狀表現輕微，而受SPVD感染的甘薯植株表現出明顯的矮化、葉片褪綠、花葉明脈等癥狀[11]。SPVD的發生能夠顯著影響甘薯的產量，在SPVD發生嚴重時，可使甘薯的產量損失達到90%以上，甚至絕收，其原因在于甘薯植株在感染SPVD病毒后,其葉片葉綠素含量降低導致光合速率下降，進而影響甘薯的產量[12-14]。有研究表明，SPFMV在我國不同甘薯產區普遍存在，而種薯是否攜帶SPCSV則是苗期甘薯病毒病發生的關鍵因素[4,15-16]。因此，推廣和應用甘薯脫毒種苗，可以有效地防止病毒病造成的危害。

病毒檢測是脫毒苗生產和田間苗病毒鑒定的重要環節之一，甘薯病毒病常用的檢測方法有癥狀學診斷法、指示植物檢測法(生物學檢測法)、血清學檢測法、分子生物學檢測法等。以聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)為代表的分子生物學檢測技術正逐步成為病毒檢測的主要方法。PCR技術的應用彌補了癥狀學診斷法、指示植物檢測法、血清學檢測法的不足，如準確性低，檢測周期長，假陽性反應率高等。常規PCR技術檢測一次只能檢測一種病毒，對于復合侵染的病毒需要進行多次PCR反應，操作較為煩瑣。而多重PCR是在普通的單一PCR基礎上發展起來的，可以同時擴增多個基因，具有靈敏、快速、高效、成本低、特異性強、步驟簡便等特點，適合進行大量甘薯樣品的檢測[17]。目前關于應用多重PCR對2種及以上的甘薯病毒的檢測已有相關研究[18-21]，但對于SPLCV、SPFMV和SPCSV 3種病毒的多重RT-PCR檢測鮮見相關報道。建立針對以上3種常見甘薯病毒的多重PCR檢測技術具有廣闊的應用前景。筆者以單一PCR為基礎，全面優化多重PCR反應體系，建立了以上3種常見甘薯病毒的多重PCR檢測體系，以期為甘薯病毒檢測提供一種簡便、快捷的分子生物學方法，為甘薯田間病毒鑒定和甘薯脫毒苗的生產提供有效的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料材料：供試甘薯樣本為采自河南新鄉的帶有明顯病毒癥狀的甘薯田間樣本；將經過檢測不含SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種病毒的甘薯脫毒組培苗作為陰性對照。

試劑：植物DNA提取試劑盒、植物總RNA提取試劑盒購自百奧曼公司，反轉錄試劑盒、2×TaqMix Pro(+Dye) 購自莫納生物公司，SPLCV病毒重組質粒(含SPLCV CP基因)、SPFMV病毒重組質粒(含SPFMV CP基因)、SPCSV病毒重組質粒(含SPCSV CP基因)由河南華智營養科技有限公司構建保存，其他所應用的試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1引物設計與合成。根據NCBI數據庫中收錄的SPLCV、SPFMV和SPCSV[21]外殼蛋白(CP)基因的核苷酸保守序列和文獻分別設計和合成引物。引物均由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

表1 甘薯病毒的特異性引物

1.2.2核酸的提取。稱取約100 mg的甘薯葉片，經液氮研磨后按照植物總RNA提取試劑盒和植物總DNA提取試劑盒說明書分別提取甘薯葉片RNA和DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳分別檢測RNA和DNA的提取質量。

1.2.3單一PCR反應體系和條件。采用MonScriptTM RTⅢ Super Mix with dsDNase (Two-step)的說明書進行反轉錄試驗，獲取待測樣品的第1鏈cDNA，并以獲取的高質量DNA或cDNA作為模板，分別對3種病毒進行特異性擴增檢測。單一PCR反應體系：2×TaqMix Pro(+Dye) 10.0 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA模板或cDNA模板各1.0 μL，無菌水補足至20 μL。具體反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，循環數為35；72 ℃最終延伸10 min。

待PCR擴增反應結束后，取5 μL擴增反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結束后，采用凝膠成像儀進行結果分析和記錄。

1.2.4多重PCR檢測反應條件的優化和建立。以SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種病毒基因組混合質粒作為模板，參考單一PCR反應體系，加入以上3種病毒的特異性引物進行多重PCR反應，對能夠影響多重PCR的幾個主要條件(引物添加量、退火溫度、循環數)依次進行優化，在進行某一個條件的優化時，應保持其他反應條件不變。

引物SPLCV-F/R∶SPFMV-F/R∶SPCSV-F/R的使用量比例設置5個處理：0.5 μL/0.5 μL∶0.5 μL/0.5 μL∶0.5 μL/0.5 μL；0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL∶0.2 μL/0.2 μL；0.1 μL/0.1 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL；0.2 μL/0.2 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL；0.4 μL/0.4 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL。

循環數分別設25、30、35、40次；退火溫度分別設48、52、56、 58、62 ℃。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5多重PCR的特異性檢測。分別以構建完成的SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種病毒基因組質粒作為模板，應用超微量紫外分光光度計測定DNA濃度，根據阿伏伽德羅常數將濃度換算為拷貝數。以濃度分別為107拷貝/μL的SPLCV、SPFMV、SPCSV病毒基因組重組質粒當作模板，進行多重PCR，檢測反應體系的特異性。同時，利用經檢測不含有甘薯病毒的組培苗樣品測試多重PCR體系的特異性。

1.2.6多重PCR的靈敏性檢測。將SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種病毒的基因組重組質粒混合，隨后進行10倍稀釋，選取濃度為106、105、104、103、102拷貝/μL 5個濃度梯度的3種病毒混合質粒作為檢測模板，進行多重PCR檢測，以進行多重PCR的靈敏性檢測。

1.2.7多重PCR的初步應用。從新鄉市郊區采集帶有相應病毒癥狀的甘薯田間樣本，利用建立的多重PCR體系進行檢測。

1.2.8PCR產物的測序與序列分析。切膠回收部分多重PCR擴增產物，并將回收后的PCR產物送至武漢金開瑞生物工程有限公司進行測序，測序完成后，利用BLAST工具、DNAMAN軟件將測序結果進行序列比對和同源率分析。

2 結果與分析

2.1 病毒總RNA和DNA提取及質量檢測分別利用植物總RNA提取試劑盒和RNA提取試劑盒獲取質量較高的核酸。RNA凝膠電泳顯示(圖1a)，28S rRNA、18S rRNA條帶清晰，28S和18S的亮度比為1.5∶1.0～2.0∶1.0，無DNA條帶，無拖尾及彌散條帶，表明蛋白質和酚類物質基本去除，且完整性良好，可以進行后續試驗。DNA凝膠電泳結果顯示(圖1b)，基因組條帶單一明亮，無彌散條帶，說明DNA沒有發生降解，純度較高，可以進行后續試驗。

圖1 甘薯葉片總RNA(a)、總DNA(b)瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

2.2 多重RT-PCR反應體系的優化和確立以帶有病毒甘薯樣品的DNA/cDNA作為模板，分別利用SPLCV、SPFMV和SPCSV 3種病毒的特異性引物進行單一PCR擴增，分別擴增出180、295、774 bp的特異性條帶，符合預期目的條帶大小(圖2a)。在對SPLCV、SPFMV和SPCSV 3種病毒的多重RT-PCR反應體系的優化方案中，以單一RT-PCR作為基礎，分別對引物添加量、退火溫度、循環次數進行優化。3對特異性引物不同添加量優化試驗結果顯示，3對引物不同添加量組合對擴增產物的影響較大，對774和180 bp的目的條帶擴增影響尤為明顯，綜合比較在不同添加量情況下3條目的條帶的擴增亮度，多重PCR檢測體系的選擇引物配比組合為：0.2 μL/0.2 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL，且3種病毒擴增的目的條帶均比較明亮(圖2b)。退火溫度優化試驗顯示，退火溫度為48、52 、56、 58 、62 ℃時，均可擴增出目的條帶，在58 ℃時，各目的條帶擴增有效性接近，因此選擇58 ℃作為多重PCR的最佳退火溫度(圖2c)。當循環數為25、30、35、40次時，均能擴增出目的條帶，且隨循環數增加，774bp的目的條帶亮度不斷增加，其中當循環次數分別為35和40次時，兩者差異不大，綜合考慮，選擇35次作為最優的循環次數(圖2d)。根據以上不同條件的優化結果，最終確定多重RT-PCR最佳反應體系為：2×TaqMix Pro(+Dye) 10 μL,SPLCV上下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL,SPFMV上下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL,SPCSV上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA/cDNA模板各1.0 μL，補足ddH2O至20 μL。反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃最終延伸10 min。

注：M.DL Marker 2000；a.單一PCR檢測結果(泳道1～3：SPLCV、SPFMV、SPCSV)；b.引物濃度優化結果(泳道1～5：SPLCV-F/R∶SPFMV-F/R∶SPCSV-F/R的添加量分別為0.5 μL/0.5 μL∶0.5 μL/0.5 μL∶0.5 μL/0.5 μL；0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL∶0.2 μL/0.2 μL；0.1 μL/0.1 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL；0.2 μL/0.2 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL；0.4 μL/0.4 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL；c.退火溫度優化結果(泳道1～5：48、52、56、58、62 ℃)；d.循環數優化結果(泳道1～4：25、30、35、40次)

2.3 多重PCR檢測體系的特異性特異性檢測試驗結果表明，利用建立的多重PCR方法均能在單一質粒、兩兩混合質粒和3種混合的質粒中擴增出對應的目的條帶，而從不含有病毒的脫毒組培苗樣品中未擴增出目的條帶(圖3)。這說明建立的多重PCR檢測體系具有良好的特異性。

注：M.DL 2000 DNA 分子量標準：泳道1.SPLCV;泳道2.SPFMV;泳道3.SPCSV;泳道4.SPLCV+SPFMV;泳道5.SPLCV+SPCSV;泳道6.SPFMV+SPCSV;泳道7.SPLCV+SPFMV+SPCSV;泳道8.脫毒苗樣品

2.4 多重PCR的靈敏性靈敏性試驗結果表明，建立的多重PCR方法對SPLCV、SPFMV和SPCSV的最低檢出濃度為104拷貝/μL(圖4)。這表明該體系可以實現對以上3種甘薯病毒104拷貝水平的檢測。

注：M.DL 2000 DNA 分子量標準:泳道1～5.106、105、104、103、102拷貝/μL

2.5 多重PCR檢測方法的應用利用優化后的多重PCR體系檢測甘薯田間樣本(圖5)。甘薯田間樣品多為不同病毒的復合侵染。從圖5可見，樣品2、3擴增3條目的條帶，為SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種病毒復合侵染。樣品1、4、5擴增出2條目的條帶，為SPLCV和SPFMV的復合侵染。該研究建立的多重PCR方法可以在含有不同病毒的甘薯葉片樣本中擴增出相應病毒的目的條帶，并能夠清晰地分辨出SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種病毒。

注：M.DL 2000 DNA分子量標準；泳道1～5.甘薯田間樣品；泳道6.陰性對照

2.6 多重PCR擴增產物的鑒定將經多重PCR擴增的SPLCV、SPFMV、SPCSV的條帶進行測序,并將測序結果與NCBI中的參考病毒基因序列進行同源性比對分析，SPLCV多重PCR擴增產物與日本、美國、廣東、山東、四川分離物的核苷酸同源率均在94%及以上，其中，與日本分離物的核苷酸同源率達到98%(圖6a)；SPFMV多重PCR擴增產物與澳大利亞、中國、西班牙、日本、韓國分離物核苷酸同源率在94%以上，其中，與澳大利亞分離物核苷酸同源率達到99%(圖6b)；SPCSV片段與西班牙、河南、山東、廣東、四川同源率在97%及以上(圖6c)。這說明根據設計的特異性引物建立的多重PCR體系對于3種病毒的檢測具有廣泛的適用性和可靠性。

注：a.SPLCV多重PCR擴增產物與SPLCV參考分離物核苷酸序列的同源率比對；b.SPFMV多重PCR擴增產物與SPFMV參考分離物核苷酸序列的同源率比對；c.SPCSV多重PCR擴增產物與SPCSV參考分離物核苷酸序列的同源率比對

3 討論與結論

目前核酸擴增技術仍是進行甘薯病毒檢測一項快速準確的技術，包括多重PCR技術[18-21]、熒光定量PCR技術[22-24]、LAMP恒溫擴增技術[25-27]、RPA重組酶聚合酶擴增技術[28]等方法。其中，熒光定量PCR技術有更高的靈敏性，但在進行多個病毒檢測時需要針對不同病毒設計特異性探針，成本較高；LAMP恒溫擴增技術具有特異性高、擴增結果可視化等優點，但卻存在引物設計復雜、易產生非特異性擴增等缺點；RPA重組酶聚合酶技術具有反應條件溫和、時間短、靈敏度高等優點，但作為新興技術，其研究仍不成熟[29-31]。因此，多重PCR作為一項兼具費用低廉、操作簡單、結果精確等特點的技術，仍是進行多種病毒同時檢測經濟有效的手段。與單重PCR相比，多重PCR技術可以在同一個反應體系中加入2對及以上的特異性引物，實現多個目的基因同時擴增的目的[32]。多重PCR的檢測會存在不同引物對之間相互抑制或產生非特異性擴增等問題。在建立多重PCR反應體系時，應當合理選擇引物，并對反應體系和反應條件不斷優化，調整出適宜的反應條件和體系。目前，多重PCR檢測體系已廣泛應用于甘薯病毒病的檢測，王爽等[18]應用多重PCR檢測了菜豆金色花葉病毒屬病毒和甘薯褪綠矮化病毒，許泳清等[19]利用雙重RT-PCR檢測甘薯褪綠矮化病毒和甘薯羽狀斑駁病毒，蔣素華等[20]運用多重RT-PCR建立了甘薯的褪綠矮化病毒、潛隱病毒、羽狀斑駁病毒的檢測體系。

因此，該研究在前人研究的基礎上，探索建立檢測SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種病毒的多重PCR體系。該研究通過參考相關文獻[33]，設計不同病毒的特異性引物且各目的片段大小有一定差異，SPLCV、SPFMV和SPCSV 3種病毒目的條帶的大小分別為180、295和774 bp，能有效區分目標病毒，便于檢測結果的觀察分析。通過對引物濃度的摸索試驗，確定了SPLCV、SPFMV、SPCSV的上下游引物添加量分別為0.2 μL/0.2 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL；退火溫度優化和循環數優化試驗表明，退火溫度為 58 ℃時，循環數為35次時，擴增效果最好。靈敏度試驗和特異性試驗表明，建立的多重PCR體系可以實現104拷貝/μL病毒的檢測，且具有良好的特異性。該研究采用2×TaqMaster mix預混液極大地優化了操作步驟，并檢測5份甘薯田間樣品，準確、靈敏地檢測出復合侵染的甘薯病毒，其中樣品2、3為3種病毒復合侵染，且受SPLCV侵染較輕。此外，在樣品2、3中，SPFMV的亮度明顯高于SPCSV，表明樣品中SPFMV的病毒含量更高，這可能是由于SPCSV與SPFMV共同侵染甘薯時，SPFMV病毒含量比單獨侵染時增加600倍有關[34]。樣品1、4、5為2種病毒復合侵染。總之，該研究通過選擇和設計特異性引物，優化影響多重PCR反應的主要條件，建立針對SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種甘薯病毒的多重PCR檢測體系，該體系可實現對3種甘薯病毒104拷貝/μL水平的檢測，具有良好的特異性和廣泛的適用性，可對田間采集的甘薯樣品進行快速準確的檢測，不僅能夠促進甘薯病毒檢測技術的發展，還可為甘薯病毒的檢測和防控提供技術支持。