馬鈴薯早疫病病原菌的分離鑒定及品種早疫病抗性評價

李秀華，梁瑞萍,張仙保，李文霞,王亮明

(包頭市農牧業科學研究院，內蒙古包頭 014013)

馬鈴薯早疫病(potato early blight)俗稱夏疫病、輪紋病或干斑病，在我國和世界各馬鈴薯產區分布較為普遍，嚴重地塊發病率大于80%，減產達30%以上[1-4]。該病主要為害葉片，也能侵害葉柄、莖和薯塊。葉上病斑最初為褐色圓形斑點，以后逐漸擴大成圓至近圓形，褐色至暗褐色，病斑邊緣明顯，有清晰的同心輪紋，有時病斑外緣有較窄的黃色暈圈。據報道，馬鈴薯早疫病主要由茄鏈格孢菌(Alternariasolani)引起[5]，另有研究表明馬鈴薯早疫病的病原菌分別為Alternariasolani和Alternariaalternata[6]。包頭地區是內蒙古自治區種薯和商品薯的主產區之一，早疫病是常發病害，危害較為嚴重。為確定當地早疫病病原菌的歸屬，筆者采用常規組織分離法對包頭地區的馬鈴薯早疫病病原菌進行分離鑒定，并利用苗期噴霧接種對部分馬鈴薯品種早疫病抗性進行鑒定，以期為包頭地區馬鈴薯早疫病的綜合防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離和純化2019年6月陸續在包頭市農牧業科學研究院院內和固陽縣馬鈴薯試驗區采集具典型同心輪紋的馬鈴薯早疫病病葉，依據常規組織分離法進行病原菌的分離、純化，得到供試菌株，命名為“mls1”。將病原菌保存于PDA斜面上，置于4 ℃冰箱保存。

1.2 病原菌的形態學觀察用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取一圈菌餅，挑針挑取菌餅接種于新的PDA平皿上，28 ℃恒溫黑暗培養3～7 d。肉眼觀察菌落顏色、形態、氣生菌絲特點，OLYMPUS CX31顯微鏡下觀察病原菌的形態結構。4～10 d后顯微鏡下觀察分生孢子形態，測量分生孢子的大小，包括長、寬、橫縱隔膜數、孢子顏色等。參考張天宇等[7-8]對鏈格孢屬的特征描述進行鑒定。

1.3 病原菌的致病性測定病原菌置于PDA固體培養基上28 ℃恒溫黑暗培養，7 d后用無菌水洗脫分生孢子，利用血球計數板制備成1×107個/mL孢子懸浮液。采用離體葉片法[9]，取新鮮無病蟲害的馬鈴薯葉片，無菌水沖洗后置于75%乙醇中振蕩消毒2 min，無菌水漂洗3次，置于鋪有無菌濕濾紙的平皿內。采用涂抹法將孢子懸浮液接種于消毒后的馬鈴薯葉背面，空白對照以無菌水處理，置于25 ℃光照培養箱內培養，接種后每24 h觀察1次。依據柯赫氏法則，發病后從病斑處再次分離病原菌，并與原接種菌進行比較。

1.4 病原菌rDNA-ITS 序列鑒定收集在PDA平板上培養8～10 d 的早疫病菌菌絲體，采用CTAB法提取病原菌基因組DNA[10]。利用真菌核糖體rDNA 轉錄間隔區(ITS) PCR 擴增的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對提取的真菌總DNA進行PCR擴增。PCR 反應體系(25 μL)：2.0 μL dNTPs(10 mmol/L)，5.0 μL 10×Reaction buffer(with MgCl2)，0.5 μLTaq聚合酶(5 U/μL)，ITS1(10 μmol/L)和ITS4(10 μmol/L)各2.0 μL，2.0 μL模板DNA(30 ng/μL)，11.5 μL ddH2O。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性 45 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，30 個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀GelDoc-it2imager下觀察照相，觀察到預期條帶后，PCR產物委托上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.5 抗病性接種鑒定試驗于2020年5月10日在包頭市農牧業科學研究院育苗溫室進行，供試品種購自內蒙古自治區固陽縣精誠脫毒馬鈴薯繁育中心，種薯級別為原原種，經催芽后種植于花盆內，花盆內為育苗基質。每個品種播種25盆，每盆1粒，共計12個品種，3次重復。6月2日參試品種全部出苗。于4葉期噴霧接種鑒定菌株分生孢子懸浮液，分生孢子濃度為1×104個/mL，保濕(RH=100%)48 h后常規管理。溫室溫度為20～32 ℃。接種3 d后開始觀察，第7天對供試品種逐葉按照9級標準調查發病率和病情指數。

馬鈴薯早疫病病害分級標準[11]，0級：葉片無病斑；1級：病斑面積占整個葉面積5%及以下；3級：病斑面積占整個葉面積6%～10%；5級：病斑面積占整個葉面積11%～20%；7級：病斑面積占整個葉面積21%～50%；9級：病斑面積占整個葉面積50%以上。抗病性評價標準[12]：免疫(I)，病情指數0；高抗(HR)，病情指數0～0.10；抗病(R)，病情指數0.11～20.00；中抗(MR)，病情指數20.01～40.00；中感(MS)，病情指數40.01～60.00；感病(S)，病情指數在60.01以上。

發病率(%)=發病葉片數/調查葉片數×100

2 結果與分析

2.1 病原菌形態特征將馬鈴薯早疫病病原菌“mls1”接種在PDA培養基上，于28 ℃恒溫黑暗培養，如圖1所示，其氣生菌絲體生長快，較發達，初期氣生菌絲灰白色，約4 d后轉為灰綠色。PDA平皿上培養菌落形成以接種菌餅為中心的同心圓，約8 d長滿直徑9 cm的培養皿。如圖2所示，顯微鏡下觀察到氣生菌絲有隔膜和分支，分生孢子梗顏色黃褐色，單生或呈分支狀，較菌絲短且寬，寬5～10 μm。28 ℃恒溫黑暗培養至4 d后，顯微鏡下可觀察到分生孢子，由孢子梗頂端產生，單生或簇生，淡黃色至黃褐色，形態多樣，為短棍形、梨形、長橢圓形等。1～4個橫膈膜，0～3個縱、斜膈膜，大小多在(30～70) μm×(15～25) μm，多數頂端具喙，喙寬約5 μm。

注：a.培養7 d時菌落背面形態；b.培養7 d時菌落正面形態

圖2 馬鈴薯早疫病“mls1”分生孢子形態

2.2 病原菌致病性將分離純化后得到的馬鈴薯病原菌“mls1”菌株的分生孢子懸浮液接種于馬鈴薯健康離體葉片上，25 ℃恒溫保濕光照培養，約4 d，接種“mls1”菌株的葉片出現典型的同心輪紋癥狀，空白對照無癥狀。對接種后表現典型早疫病癥狀的馬鈴薯病斑進行再分離、純化，得到與原菌株一致的病原菌。依據柯赫氏法則，證實標記為“mls1”的原接種菌株為馬鈴薯早疫病的病原菌。

2.3 病原菌rDNA-ITS 序列鑒定利用CTAB法提取病原菌“mls1”基因組DNA，如圖3所示，馬鈴薯早疫病菌基因組DNA大小約在5 000 bp，無降解，無污染。所提DNA經超微量分光光度計Thermo NanoDrop 2000定量到30 ng/μL，備用。利用真菌核糖體rDNA轉錄間隔區( ITS) PCR 擴增的通用引物 ITS1和ITS4對提取的真菌總DNA進行PCR擴增，在早疫病病原菌基因組DNA中擴增出1條540 bp左右的片段。PCR產物委托上海生工生物工程有限公司進行測序，結果表明，病原菌“mls1”的rDNA-ITS區大小為542 bp，將該序列與GenBank中已登錄序列進行Blast比對。如圖4所示，該菌ITS序列與鏈格孢屬Alternaria同源性高，為100%，結合形態特性確定該病原菌為鏈格孢屬真菌。

圖3 馬鈴薯早疫病病原菌“mls1”基因組DNA(a)和ITS區PCR擴增產物(b)

圖4 馬鈴薯早疫病病原菌ITS序列Blast比對結果

2.4 不同品種馬鈴薯早疫病抗性接種鑒定溫室對12個馬鈴薯品種早疫病抗性接種鑒定，發現接種后3 d馬鈴薯葉片開始出現發病點，之后病斑開始擴展，約7 d形成輪紋狀病斑，部分葉片干枯，之后發病進展緩慢。在供試的12個馬鈴薯品種中，僅“中薯3號”病情指數為23.44，依據抗病性評價標準可知，其對早疫病抗性評價是中抗。除“中薯3號”外，其余品種均是早疫病抗性品種，其中“荷蘭15”發病率和病情指數最高(表1)。

表1 不同馬鈴薯品種抗病性接種鑒定

3 結論與討論

馬鈴薯早疫病在內蒙古馬鈴薯主產區是常發病害，尤其夏季雨熱同期發病較重，可侵染塊莖，對馬鈴薯產量造成一定影響[13-15]。該研究利用rDNA-ITS 序列鑒定，將所分離馬鈴薯早疫病菌株鑒定到鏈格孢屬(Alternaria)，未鑒定到種，這與已有報道類似[16-17]，下一步需設計特異性引物，再次進行鑒定。

同時，接種鑒定了包頭地區一些市場栽培品種對早疫病的抗性，其中“中薯3號”屬于中抗品種，其余屬于抗性品種，在抗性品種中“荷蘭15號”病情指數最高。趙艷群等[18]對部分馬鈴薯品種的早疫病田間抗性進行評價，其中“中薯3號”同為中抗品種，但病情指數高于該試驗。Stewart等[19]以14個基因型馬鈴薯為試材，對其早疫病抗性進行了評價，認為溫室接種鑒定和田間自然發病抗性鑒定結果一致。梁偉伶[20]對部分馬鈴薯品種進行了田間抗性鑒定和接種鑒定，評價結果略有不同。