硒納米顆粒對兩種葉菜作物肥料效應的田間試驗研究

劉曉飛，劉 晶，王傳洗*，王震宇

1.江南大學環境與土木工程學院，江蘇無錫 214122

2.江南大學環境過程與污染控制研究所，江蘇無錫 214122

硒(Se)是人體必不可少的微量元素之一，被稱為“生命的保護劑”[1].人體想要補充Se元素，目前被承認的最健康的方法是飲食補Se[2].然而，我國屬于低Se地帶，容易導致作物富Se量不足[3].發展富Se農產品產業成為農業結構調整的重要措施[4].常見的傳統Se肥(如亞硒酸鈉)容易被土壤固定，最終導致植物對Se的利用率較低，殘留在土壤中的Se對環境和人體健康都存在一定威脅[5].硒納米顆粒(Se NPs)的出現打破了僵局，低毒性和高生物活性等特性使其在農業領域的應用受到了廣泛關注[6-7].

近年來，以納米顆粒(NPs)生產的納米肥料、納米農藥、納米農業傳感器等新穎納米農業產品，在提高作物產量、提升作物品質和降低病蟲害等方面已經顯現出巨大潛力[8-10]. NPs在現代農業中的應用受到了全世界學者前所未有的關注[11-12].已有研究表明，Se NPs可用于改善茶葉的品質，與對照相比，Se NPs(10 mg/L)顯著提高了蛋白質、可溶性糖、類胡蘿卜素、茶多酚和兒茶素的含量[6].Li等[13]發現，葉施Se NPs(20 mg/L)可以激活苯丙烷和支鏈脂肪酸途徑以及相關酶和基因表達，促進辣椒中辣椒素、類黃酮和總酚的合成，這些化合物具有抗炎、抗癌、抗氧化等保健功能.同時，筆者所在課題組的近期(2022年)盆栽試驗發現，土壤施加Se NPs(0.5 mg/kg)能夠增加油菜根際有益微生物的豐度及低分子量有機酸的含量，從而提高了土壤中養分的釋放，促進植物對這些養分的吸收；同時，根系低分子量有機酸能夠減少Se NPs在土壤中的固持，促進Se在作物內的吸收[14].然而，目前的研究大多在盆栽中進行.田間真實復雜環境下，Se NPs促進作物生長及品質的肥料效應研究較少.

該研究以小油菜和生菜兩種作物為研究對象，通過比較傳統Se肥(亞硒酸鈉)和Se NPs對兩種作物生長、富Se情況的影響，研究Se NPs對葉菜類作物促生和富Se的普適性，并探究Se NPs可能對土壤環境產生的影響，以期為Se NPs作為新型Se肥在農田應用中的可行性做進一步了解.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小油菜種子購自合肥合豐種業有限公司，發芽率不低于85%.供試生菜種子購自河北茂華種業有限公司，發芽率不低于85%.

Se NPs通過固相還原法制備[15].Se NPs的形貌和粒徑通過透射電子顯微鏡(TEM，JEM-2100，日本)觀察測定，表面電荷由納米粒度儀(Nano ZS90，馬爾文，英國)測定獲得.

透射電子顯微鏡視野下，Se NPs的形貌呈球形〔見圖1(a)〕；對Se NPs的粒徑進行統計發現，其粒徑主要分布在30~40 nm之間.Se NPs的Zeta電位在?31.45 mV左右〔見圖1(b)〕.傳統Se肥選擇亞硒酸鈉(Na2SeO3含量≥98%，國藥集團化學試劑有限公司).

圖1 Se NPs的透射電鏡圖和Zeta電位Fig.1 TEM and Zeta potential of Se NPs

1.2 試驗設計

田間試驗分別在江蘇省無錫市濱湖區馬山街道(小油菜，試驗區海拔為3.4 m，地理位置31.4°N、120.1°E，單個小區面積為1 m×1 m，總面積為4 m×5 m)和江蘇省蘇州市昆山市千燈鎮(生菜，試驗區海拔為5.7 m，地理位置31.4°N、120.9°E，單個小區面積為1 m×1 m，總面積為7 m×10 m)進行，種植過程不施加化肥，田間土壤理化性質見表1.土施濃度根據已有研究[16]設置為0.05 mg/kg，分別設置無任何添加(CK)、添加Se NPs和添加亞硒酸鈉(圖表中表示為Selenite)共3個處理，每個處理重復3次.

表1 無錫濱湖區和蘇州昆山市的田間土壤理化性質Table1 Physical and chemical properties of field soils in Binhu (Wuxi)and Kunshan (Suzhou)

1.3 測定方法

使用根掃儀(WinRHIZO Pro 2017b，Regent，加拿大)分析小油菜和生菜的根系參數(根長、根表面積、根體積).小油菜和生菜的生物量以每株地上部的鮮質量表示.

將干燥樣品(植物樣品25 mg，土壤樣品15 mg)與3 mL去離子水和3 mL濃硝酸(GR，65%~68%)混合，在微波消解反應系統(Mars 6，CEM，美國)中消化.用0.22μm的微孔膜過濾后，用去離子水稀釋至50 mL，待測.采用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS，iCAP-TQ，Thermo Fisher，美國)分析不同處理下植物組織和土壤中元素(P、K、Fe、Cu、Zn、Mn、Mo和Se)的含量[17].標準曲線采用國家有色金屬與電子材料分析測試中心(GNM-M203814-2013)的多元素標準溶液配置，內標元素為鍺Ge(GSB 04-2826-2011，國家有色金屬與電子材料分析測試中心)，各元素的加標回收率在84.9%~102.9%之間，儀器運行穩定.葉片和土壤中TOC、TN含量由元素分析儀(UNICUBE，ELEMENTAR，德國)測定[18].

采用2,6-二氯靛酚滴定法[19]測定小油菜葉片中的抗壞血酸(Vc)含量.

將50 mg新鮮葉片在液氮中均勻研磨，置于2 mL離心管中，加入1.5 mL 80%甲醇水溶液(含0.1%甲酸和內標液)進行渦流混合.冰浴超聲30 min(35 kHz)后，將上清液(12 000 r/min，4℃)離心15 min.用離心濃縮機真空干燥上清液，再溶于200μL的復溶液(V甲醇∶V乙腈∶V水=4∶4∶2)中. 離心(12 000 r/min，4℃)10 min得到上清液，?20℃下保存待測.以L-2氯苯丙氨酸為內標，取各樣品等量混合均勻作為質控樣品(QC).采用超高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS，Thermo Fisher，德國)分析代謝產物[20-21].

1.4 數據處理

測定數據以平均值±標準差(Mean±SD)表示，采用OriginPro 2019b程序進行制圖.采用單因素方差分析比較不同處理之間的差異.分析結果采用Fisher/Tukey檢驗，P<0.05認為差異具有統計學意義.采用Compound Discoverer software 3.1和Metabo Analyst(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml)進行質譜數據分析.

2 結果與討論

2.1 Se NPs對小油菜和生菜生物量的影響

在農田生態環境中土施Se NPs(0.05 mg/kg)可促進小油菜的生長.與CK相比，Se NPs可以顯著提高小油菜的根長、根表面積、根體積以及生物量，其中根表面積和根體積分別提高了47.4%和52.0%〔見圖2(A)~(C)〕，小油菜的地上可食用部位的鮮質量較CK增加了108.2%〔見圖2(D)〕.

將Se NPs應用于土施培養生菜，發現Se NPs同樣促進了生菜的生長.Se NPs可促進生菜根系的生長，與CK相比，根長、根表面積和根體積分別提高了53.8%、74.7%和85.7%〔見圖2(A)~(C)〕，地上部鮮質量增加了90.9%〔見圖2(D)〕.因此，農田環境中施用Se NPs提高葉菜類作物生物量是可行的，然而農田環境中施用同濃度的亞硒酸鈉對葉菜類作物的促生效果并不理想.在施用亞硒酸鈉后，生菜和小油菜的根長、根表面積以及生物量與CK相比均無統計學差異，只有生菜的根體積在施用亞硒酸鈉后與CK相比增加了79.1%.因此與亞硒酸鈉相比，土施Se NPs對葉菜類作物的促生效果更顯著.

圖2 Se NPs和亞硒酸鈉對葉菜類作物生長情況的影響Fig.2 Effects of Se NPs and sodium selenite on the growth of Brassica chinensis L.(rapeseed)and Lactuca sativa L.var.ramosa Hort (lettuce)

2.2 農田環境中Se NPs對小油菜和生菜微量元素的影響

施用Se NPs可以促進葉菜類作物中微量元素的積累.與CK相比，Se NPs處理組小油菜葉片中Fe、Cu、Zn、Mn、Mo和Se的含量分別提高了48.1%、18.9%、38.7%、9.6%、102.6%和185.7%；同樣，生菜葉片中Cu、Zn、Mn、Mo和Se的含量分別提高了8.5%、28.6%、72.2%、51.9%和60.4%(見表2).Fe和Mn均是光合作用的重要元素，Fe是植物體葉綠素合成的重要元素[22]，Mn是光系統Ⅱ中四錳團簇(Mn4)的必需元素，在光合作用放氧反應中起到重要作用[23].因此，農田環境中Se NPs可以通過分別調控小油菜和生菜對Fe和Mn的積累，對光合作用產生影響，最終促進生物量的提升.

表2 Se NPs對農田環境中小油菜和生菜微量元素的影響Table2 Effectsof Se NPs on trace elements of rapeseed and lettuce in farmland environment

此外，在土施Se NPs后，小油菜中Se含量增加了200.9μg/kg，而生菜中Se含量增加了119.2μg/kg，這可能是受到了土壤有機質的影響.土壤中的有機質可以增加土壤表面的負電荷量，降低負電荷Se NPs被土壤吸附固定的可能性[24].無錫濱湖大田(青菜)中土壤有機質含量高于江蘇昆山大田(生菜)，其土壤中Se NPs不容易被固定，具有較高的有效性；此外，植物吸收硒還與植物種類有關，一般作物中十字花科植物對硒的積累能力最強[25]，這也可能是小油菜富硒效果更好的原因.

2.3 農田環境中Se NPs對小油菜和生菜營養品質的影響

2.3.1 Se NPs對小油菜和生菜葉片Vc含量的影響

土施Se NPs可以促進葉菜類作物葉片中Vc水平的提高(見圖3).結果表明，農田環境中土施Se NPs使小油菜Vc含量提高了127.5%，其次，亞硒酸鈉也在一定程度上提高了小油菜的Vc含量；同樣，Se NPs使生菜的Vc含量提高了約23.1%.研究發現，生菜中的Vc水平低于小油菜中的Vc水平，這可能與葉片中的Se含量有關(Se更容易在小油菜中富集).研究表明，Se NPs能夠促進小油菜的光合作用，增加Vc的含量[24].

圖3 Se NPs對小油菜和生菜Vc含量的影響Fig.3 Effectsof Se NPs on Vc content in rapeseed and lettuce

2.3.2 農田環境中的小油菜葉片代謝組學分析

通過上述分析可知，與生菜相比，小油菜的相關生理生化以及代謝指標可能變化更顯著.因此，該研究以小油菜為研究對象，利用代謝組學分析方法詳細分析Se NPs對葉菜類作物營養品質的影響.如圖4所示，小油菜的代謝產物主要歸屬于氨基酸代謝途徑(24.3%)和類黃酮代謝途徑(6.8%).此外，與CK相比，Se NPs處理后的小油菜中歸屬于氨基酸和類黃酮代謝途徑的代謝產物相對豐度分別提高了22.7%和37.1%(見圖5).

圖4 小油菜葉片中代謝產物的分類Fig.4 Classification of metabolites in leaves of rapeseed

圖5 小油菜葉片中氨基酸和類黃酮的相對豐度Fig.5 Total relativeabundance of amino acidsand flavonoids in leavesof rapeseed

氨基酸和類黃酮對人體健康有極大的益處[26].對小油菜代謝產物中幾種氨基酸的分析發現，與CK相比，施用Se NPs處理組的小油菜中苯丙氨酸、蘇氨酸和纈氨酸的相對豐度分別提高了26.8%、31.6%和39.1%〔見圖6(A)〕.同樣，小油菜經過Se NPs處理后，葉片中的槲皮素、山奈酚和異鼠李素等三種類黃酮的相對豐度分別較CK提高了206.0%、100.4%和41.8%〔見圖6(B)〕.這些化合物具有抗炎、抗癌、抗氧化等保健功能[27].綜上，施用Se NP可以分別提高小油菜的4種代謝途徑(氨基酸，黃酮類化合物，脂肪酸及其共軛物，以及TCA酸類化合物)中代謝物的相對豐度，提升了其營養價值，有利于促進人體健康發展.

圖6 Se NPs對小油菜中3種氨基酸和類黃酮相對豐度的影響Fig.6 Effectsof Se NPs on the relative abundanceof three amino acids and flavonoidsin rapeseed

2.4 農田施用Se NPs對土壤理化性質的影響

為了符合農田的可持續發展，減少對農用土地的污染，將Se NPs推廣到農田，需要考慮到Se NPs施用對土壤理化性質的影響.對比無錫濱湖區大田(小油菜)和江蘇昆山市大田(生菜)施用Se NPs后的土壤理化性質(見表3)發現，與CK相比，土壤pH和TOC含量都沒有明顯變化.

表3 小油菜、生菜收獲后土壤的理化性質Table3 Soil physicochemical properties of rapeseed and lettuce after harvest

這與已有的盆栽試驗結果存在差異，Wang等[14]發現，Se NPs可以引起根際土壤中有機質含量的增加以及土壤pH的降低.因此，導致農田和盆栽試驗最終的土壤性質存在差異的原因可能是，較低的pH使得土壤具有良好的酸堿緩沖能力[28]，復雜的農田生態環境會引起進入土壤中的有機質分解速度加快[29].但是Se NPs處理組的土壤TN含量有了一定程度的降低，這與前期盆栽結果[14]一致.SeNPs的施用可能改善了土壤微環境，活化土壤養分并提高了葉菜類作物對其的吸收.這些結果進一步證實了Se NPs在減少農用氮肥成本以及減輕環境污染方面的優勢.此外，更需要關注的是，與傳統Se肥(亞硒酸鈉)對比，Se NPs施用后的土壤中Se殘留量更低，這也說明更多的Se被植物有效吸收和利用，降低了Se殘留在土壤中可能造成的環境風險.

3 結論

a)與傳統Se肥(亞硒酸鈉)對比，農田施加硒納米顆粒(Se NPs)顯著促進了兩類葉菜作物(小油菜和生菜)的根系生長，增加了作物對土壤微量元素的吸收，進而提升了葉菜類作物的光合作用和生物量.

b)與傳統Se肥對比，農田施加Se NPs不僅使得葉菜類作物含Se量更高，而且顯著提高了葉菜類作物的營養品質，有助于改善人體健康.

c)與傳統Se肥對比，Se NPs的施用可以降低土壤中的Se殘留量，提高氮素利用率，達到減輕環境污染、降低環境風險的目的.