基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術的異綠原酸A大鼠體內代謝產物鑒定

鄧志鵬，張蕭，田海濤

(山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

異綠原酸A(Isochlorogenic acid A)，又名3, 5-二咖啡酰奎寧酸(3,5- Dicaffeoylquinic acid)，由一分子奎寧酸和兩分子咖啡酸縮合而成，屬于咖啡酰奎寧酸類中的二咖啡酰奎寧酸類。異綠原酸A是金銀花抗菌有效成分之一，所以被作為其質控指標成分[1]。二咖啡酰奎寧酸類具有抗炎[2]、抗病原微生物、抗菌[3]、降血糖、抗氧化[4-5]、腦缺血保護[6]，以及抗乙型肝炎病毒(HBV)和抗人體免疫缺陷病毒(HIV)活性等[7-8]作用。目前，臨床上對于慢性乙型肝炎的治療方法主要為化學藥物抗病毒治療，治療藥物主要有兩種：一類是核苷酸類，另一類是干擾素[9]。其中核苷酸類藥物在臨床中應用較多，但易于產生廣泛耐藥性，治療效果不理想；而干擾素的應用較少，主要是其不良反應較為嚴重，比如肝損傷等[10]。研究表明，二咖啡酰奎寧酸類化合物可抑制HBV和HIV病毒復制，延緩和逆轉HIV病變。因此，異綠原酸A在未來有希望研制成為治療HBV和HIV的藥物。本文對異綠原酸A大鼠體內代謝產物做了較為系統的研究，初步確證了異綠原酸A在大鼠體內的代謝產物，明確了異綠原酸A的藥效物質基礎。

1 材料

1.1 動物

健康雄性Wistar大鼠(體重200 g±20 g)5只，購自濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司(許可證號 SCXK(魯)2019 0003)。

1.2 試藥與試劑

對照品異綠原酸A(批號Y-068-190329，純度≥98%)購自成都標純化植有限公司；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

超高壓液相串接Q-Exactive Plus Orbitrap高分辨質譜(美國Thermo Fisher Scientific公司)，Sorvall Biofuge Stratos高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，WD-12氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)，大鼠代謝籠(安徽正華生物儀器設備有限公司)；IKA Vortex天才3旋渦混勻器(廣州艾卡儀器設備有限公司)，數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 異綠原酸A混懸液的配制

稱取異綠原酸A粉末適量，置于10 mL量瓶中，加入適量0.5%CMC-Na溶解，定容至刻度，配制成2.0 mg/mL異綠原酸A溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備

取異綠原酸A對照品適量, 精密稱定, 置100 mL容量瓶中, 加甲醇溶解, 定容至刻度制成對照品儲備溶液(質量濃度為50 μg/mL)。精密量取各對照品溶液0.1 mL, 置50 mL容量瓶中, 加初始流動相定容制成對照品工作溶液(質量濃度為100 ng/mL)。

2.2 樣品采集

2.2.1 血漿樣品采集

Wistar雄性大鼠5只，適應性飼養1周，實驗前禁食12 h，不禁水，采集空白全血，離心獲得空白血漿。然后按20 mg/kg劑量灌胃給予異綠原酸A溶液，分別于給藥前及給藥后0.5、1、2、4、8 h于眼眶隱靜脈叢取血0.5 mL，置于含有肝素鈉的離心管中，靜置15 min，3 000 r/min條件下離心10 min，取淡黃色血漿，于-20 ℃保存備用。

2.2.2 尿液和糞便樣品采集

雄性Wistar大鼠5只，適應性飼養1周，置于代謝籠中，禁食12 h，不禁水，收集空白尿液和空白糞便。灌胃給予異綠原酸A，收集給藥后0～12、12～24、24～48 h大鼠尿液及0～48 h糞便。合并尿液，3 000 r/ min離心10 min，取上清液于-20 ℃保存備用。合并糞便，在低于50 ℃條件下烘干后碾碎，-20 ℃保存備用。

2.3 樣品處理

將冷凍貯存的血漿、尿液或糞便(勻漿上清液)樣品室溫條件下自然解凍，精密吸取血漿300 μL，渦旋 30 s，加入甲醇1.0 mL沉淀蛋白, 渦旋3 min，12 000 r/min離心10 min，上清液40 ℃條件下氮氣流吹干，以初始流動相150 μL復溶, 渦旋10 s，12 000 r/ min離心10 min，取5 μL上清液注入UHPLC-MS系統進行分析。

2.4 樣品檢測條件

2.4.1 色譜條件

Thermo C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 1.9 μm)；流動相為0.1%甲酸(A)-乙腈(B)；梯度洗脫，0～2 min，3% B；2～24 min，3%～25% B；24～25 min，25%～95% B；25～27 min，95% B；27.0～27.1 min，95%～3% B；27.1～30.0 min，3% B。進樣室溫度為10 ℃；柱溫為40 ℃；流速為0.4 mL/min；進樣量為5 μL。

2.4.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源；離子源溫度為320 ℃；電離源電壓為3.3 kV；負離子檢測模式；掃描質量范圍m/z50～1 000；鞘氣以及輔助氣均為氮氣(純度>99.99%)，流速分別為10.5和3.0 L/min。

2.5 數據處理

超高壓液相串接Q-Exactive Plus Orbitrap高分辨質譜采集數據，Thermo Scientific Xcalibur工作站，通過比較樣品與空白對照的色譜圖和質譜圖對數據進行分析。

3 結果與分析

3.1 異綠原酸A裂解規律分析

負離子模式下，異綠原酸A準分子離子峰理論值為[M-H]-m/z515.119 5(C25H24O12)，水解脫去一個分子咖啡酰基形成m/z353.0847 8(C16H18O9)的碎片離子，該碎片離子繼續脫去一個分子咖啡酰基形成m/z191.056 1(C7H12O6)和m/z179.035 0(C9H8O4)，碎片離子m/z191.0561繼續失去一個分子H2O形成m/z173.045 4；碎片離子m/z179.035 0繼續失去一個分子CO2或一個分子H2O形成m/z135.045 2、m/z161.022 4。其裂解規律如圖1所示。

圖1 異綠原酸A推測的裂解途徑Fig.1 The proposed fragmentation pathway of isochlorogenic acid A

3.2 異綠原酸A大鼠體內代謝產物分析

根據分析得到化合物的質荷比、保留時間、特征碎片離子以及相關文獻報道[11-12]，從大鼠血漿、尿液、糞便中共鑒定出包括異綠原酸A原形成分在內的10個代謝產物，其中糞便4個(M0、M1、M2、M3)，尿液6個(M4、M5、M6、M7、M8、M9)，而血漿中未檢測到代謝產物。代謝產物的具體信息見OSID科學數據與內容。

3.2.1 大鼠糞便中代謝產物鑒定及分析

M0：保留時間tR為20.15 min，[M-H]-為m/z515.118 4，產生m/z353.089 0、m/z191.056 0、m/z179.034 5、m/z135.043 8的碎片離子，其中m/z353.089 0為異綠原酸A脫去一個分子咖啡酰基所形成，m/z191.056 0為異綠原酸A脫去兩個分子咖啡酰基形成的奎寧酸負離子，m/z179.034 5為咖啡酸骨架負離子，m/z135.043 8為m/z179.034 5失去一個分子CO2所形成。此外，M0的保留時間和二級質譜信息與對照品異綠原酸A一致，因此，推測M0為異綠原酸A原形。

M1：保留時間tR為5.22 min，[M-H]-為m/z355.104 1(C16H20O9)，較m/z353.087 8多2 Da，推測為m/z353.087 8氫化代謝產物(C16H18O9+2H)，產生m/z181.050 2、m/z137.059 8的碎片離子，m/z181.050 2較m/z179.035 0(咖啡酸骨架負離子)多兩個H，為咖啡酸負離子氫化產物，m/z137.059 8為m/z181.050 2脫去一個分子CO2形成。

M2：保留時間tR為8.28 min，[M-H]-為m/z355.103 2(C16H20O9)，較m/z353.087 8多2 Da，推測為m/z353.087 8氫化代謝產物(C16H18O9+2H)，產生m/z181.049 9、m/z173.045 0、m/z137.059 5的碎片離子，m/z181.049 9為咖啡酸負離子氫化產物(C9H8O4+2H)，m/z173.045 0為m/z181.049 9失去一個分子H2O生成，m/z137.059 5為m/z181.049 9脫去一個分子CO2形成。

M3：保留時間tR為9.04 min，[M-H]-為m/z355.103 9(C16H20O9)，較m/z353.087 8多2 Da，推測為m/z353.087 8氫化代謝產物(C16H18O9+2H)，產生m/z311.103 4、m/z191.055 8、m/z173.045 1的碎片離子，m/z311.103 9為m/z355.103 9失去一個分子CO2形成，m/z191.055 8為m/z355.103 9水解失去一個分子咖啡酰基形成，m/z173.045 1為m/z191.055 8失去一個分子H2O形成(圖2)。

注：A，C為空白樣品； B, D為給藥后樣品。圖2 大鼠糞便異綠原酸A代謝產物提取離子流圖Fig.2 The representative TIC chromatograms of rat feces samples after oral administration of isochlorogenic acid A

3.2.2 大鼠尿液中代謝產物鑒定及分析

M4：保留時間tR為13.84 min，[M-H]-為m/z355.101 8(C16H20O9)，較m/z353.087 8多2 Da，推測為m/z353.087 8氫化代謝產物(C16H18O9+2H)，二級產生m/z311.112 0、m/z179.070 7的碎片離子，其中m/z311.112 0為m/z355.101 8失去一個分子CO2生成，m/z179.070 7為咖啡酸負離子(C9H8O4)。

M5：保留時間tR為14.46 min，[M-H]-為m/z355.104 2(C16H20O9)，較m/z353.087 8多2 Da，推測為m/z353.087 8氫化代謝產物(C16H18O9+2H)，推測為m/z353.087 8氫化代謝產物(C16H18O9+2H)，二級產生m/z193.034 9 、m/z179.070 8的碎片離子，m/z191.0561為奎寧酸負離子(C7H12O6)，m/z179.070 8為咖啡酸負離子(C9H8O4)，m/z193.034 9為奎寧酸負離子還原加二氫(C7H12O6+2H)。

M6：保留時間tR為17.81 min，[M-H]-為m/z369.119 1(C17H22O9)，較m/z353.087 8多16 Da，推測為m/z353.087 8氫化和甲基化代謝產物(C16H18O9+2H+CH2),二級產生m/z193.086 6、m/z175.024 1、m/z113.023 5的碎片離子，m/z193.086 6為奎寧酸負離子還原加二氫(C7H12O6+2H)；m/z175.0241為m/z193.086 6失去一個分子H2O形成。

M7：保留時間tR為10.17 min，[M-H]-為m/z365.088 9(C17H18O9)，較m/z353.087 8多12 Da，推測為m/z353.087 8脫氫和甲基化代謝產物(C16H18O9-2H+CH2)，二級產生m/z189.055 5、m/z139.992 8、m/z113.023 8的碎片離子，m/z189.055 5為奎寧酸負離子脫氫產物(C7H12O6-2H)。

M8：保留時間tR為6.89 min，[M-H]-為m/z271.012 2(C7H12O9S)，較m/z191.056 1多80 Da，推測為m/z191.056 1硫酸化代謝產物(C7H12O6+SO3)，二級產生m/z253.108 6、m/z227.021 5、m/z191.055 3、m/z147.063 9的碎片離子，其中m/z253.108 6為m/z271.012 2失去一個分子H2O形成，m/z227.021 5為m/z271.012 2失去一個分子CO2形成，m/z191.055 3為奎寧酸負離子(C7H12O6)。

M9：保留時間tR為18.06 min，[M-H]-為m/z691.152 3(C31H32O18)，較異綠原酸A(515.119 5)多176 Da，推測為異綠原酸A的葡萄糖醛酸化代謝產物(C25H24O12+Gluc)，二級產生m/z515.119 0、m/z353.088 8、m/z191.055 7、m/z135.044 3的碎片離子，其中m/z515.119 0為m/z691.152 3失去一個分子葡萄糖醛酸而成，m/z353.088 8(C16H18O9)為m/z515.119 0水解失去一個分子咖啡酰基(C9H6O3)所形成，m/z191.055 7為奎寧酸負離子(C7H12O6)，m/z135.044 3為m/z179.035 0(咖啡酸負離子)失去一個分子CO2所形成，與原形碎片離子相同(見圖3)。

注：A、C、E、G、I為空白樣品，B、D、F、H、J為給藥后樣品。圖3 大鼠尿液異綠原酸A代謝產物提取離子流圖Fig.3 The representative TIC chromatograms of rat urine samples after the oral administration of isochlorogenic acid A

3.3 大鼠體內異綠原酸A代謝途徑分析

異綠原酸A在大鼠體內的代謝途徑主要有水解、氫化、脫氫、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等(圖4)。異綠原酸A(C25H24O12，m/z515.119 5)進入大鼠體內后，首先水解脫去一分子咖啡酰基形成單咖啡酰基奎寧酸(m/z353.087 8，C16H18O9)，單咖啡酰奎寧酸繼續水解脫去一分子咖啡酰基形成奎寧酸(C7H12O6，m/z191.056 1)和咖啡酸(C9H8O4，m/z179.035 0)，單咖啡酰奎寧酸結合兩個H還原得到氫化代謝產物(m/z355.103 5)，氫化加甲基化形成m/z369.119 1(m/z353.087 8+2H+CH2)，脫氫加甲基化形成m/z365.087 8(m/z353.087 8-2H+CH2)，發生硫酸化反應得到硫酸化代謝產物(m/z271.012 9)。

圖4 大鼠體內異綠原酸A代謝途徑推測Fig.4 Proposed metabolic pathway of isochlorogenic acid A in rats

4 討論與結論

在創新型藥物研發過程中，藥物代謝研究所起的作用越來越大，在進行藥物代謝研究時，首先要保證分析方法的可靠性，對代謝物進行結構鑒定在許多階段中都顯得尤為重要[11-12]。高分辨率質譜具有適用范圍廣、分離度好、靈敏度高的優勢，能夠提供有關中藥化學成分結構的信息，且可以與色譜技術聯用在線鑒定色譜峰，為中藥體內外成分表征提供強有力的支撐，在體內外藥物代謝物結構鑒定中的應用也越來越廣泛[13-15]。

本文采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術對異綠原酸A在大鼠糞便、尿液、血漿中的代謝產物進行了鑒定，最終根據分析得到的化合物相對保留時間、質荷比、特征碎片離子。實驗中通過灌胃給藥20 mg/kg異綠原酸A，在大鼠體內共鑒定出包括原形成分在內的10個代謝產物，其中糞便4個，尿液6個，而血漿中未檢測到代謝產物，其代謝途徑主要為水解、氫化、脫氫、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等。本研究發現大鼠灌胃給予異綠原酸A后血漿中未檢測到原形及其代謝產物，且糞便和尿液中的代謝產物也比較少，與文獻[16]報道較一致。Gong等[17]大鼠灌胃給予高劑量的異綠原酸A 200 mg/kg血漿中監測到33個代謝物，我們推測代謝物的生成與給藥劑量的增加有密切關系。

本實驗鑒定了異綠原酸A在大鼠尿液和糞便中的代謝產物，對異綠原酸A在大鼠體內的代謝途徑進行了初步推測。通過該研究對異綠原酸A在大鼠體內的代謝情況有了進一步了解，確證了異綠原酸A在大鼠體內的代謝產物，從而明確了異綠原酸A的藥效物質基礎，為研發新型抗HBV和抗HIV的藥物提供了一定的實驗依據。下一步我們將開展異綠原酸A大鼠尿液、糞便的排泄量測定評價兩種排泄途徑的差異。