Box-Behnken Design響應面法優化銀杏葉總黃酮柱層析純化工藝

畢艷艷，馬慶文，許輝，劉健，龍瑞，唐偉銘，郭田甜，郝大偉*

(1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；3.魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276006)

銀杏葉系銀杏科植物銀杏的干燥葉，臨床上具有活血化瘀、通絡止痛、斂肺平喘、化濁降脂之功效，常用于治療瘀血阻絡、胸痹心痛、中風偏癱、肺虛咳喘、高脂血癥等諸多疾病[1-3]。銀杏葉提取物系銀杏葉藥材中所提取有效部位，其主要化學成分為總黃酮類和萜內酯類化合物，總黃酮苷主要是槲皮素、山柰素、異鼠李素和兒茶素類，萜類內酯主要包括半萜類白果內酯、二萜類銀杏內酯 A、B、C、J 和 M[4-7]。國內外臨床需求顯示，銀杏葉提取物各類制劑必將成為臨床上治療心腦血管疾病、癡呆癥及抗衰老的重要藥物，因此開發銀杏葉提取物及各類制劑具有廣闊的市場前景和巨大的經濟價值。例如2020年康緣藥業所申報的銀杏內酯滴丸、銀杏二萜內酯，目前已作為1類創新藥被國家藥品監督管理局受理，必然為臨床疾病的治療提供新的手段。

2020版《中國藥典》一部收載了銀杏葉提取物的制備和質量標準分析測定方法。按照藥典要求采用稀乙醇溶液提取回流，粗提物中有較多的雜質，銀杏葉總黃酮的質量分數偏低，遠遠達不到藥典要求，需要進一步地分離和純化。藥典規定采用大孔樹脂進行純化，大孔樹脂具有價格低廉、易回收再生、易工藝放大，且毒性小等諸多的優點[8-10]。本實驗是在單因素試驗的基礎上，利用BBD(Box-Behnken Design)響應面法優化銀杏葉提取物制備過程中大孔樹脂柱層析純化工藝，優化得到的工藝能大大提高銀杏葉提取物中銀杏葉總黃酮質量分數及收率，降低工藝成本，且工藝路線合理可行，更適合于大生產。

1 材料與儀器

1.1 實驗儀器

e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；R-300型旋轉蒸發器(瑞士BUCHI公司)；Alpha 2-4 LSCbasic型冷凍干燥機(德國Christ公司)；XS204型電子分析天平(Mettler Toledo)；200 mL恒流反應器泵+蛋白壓縮柱(上海賽梵科分離技術有限公司)。

1.2 實驗材料與試劑

大孔樹脂 LX-158(西安藍曉新料股份有限公司，批號20201029005)；槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100081-201610純度99.10%)；乙醇(費縣大成酒業有限公司，批號210608，食品級；純度95%)；銀杏葉粗提物溶液(中藥制藥共性技術國家重點實驗室)；高效液相色譜儀用試劑均為色譜純；分析用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 銀杏葉總黃酮質量分數測定方法

2.1.1 色譜條件

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取槲皮素對照品適量，置于50 mL容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，放冷后加甲醇配置成0.722 6 mg/mL槲皮素對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液1 mL 置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備

2.1.4 銀杏葉總黃酮質量分數測定

分別精密吸取槲皮素對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。以槲皮素對照品峰面積為對照，按照2020版《中國藥典》上校正因子計算槲皮素、山奈酚和異鼠李素的質量分數。槲皮素、山奈酚和異鼠李素的校正因子分別為1.000 0、1.002 0、1.089 0，相對保留時間分別為1.00、1.64、1.83。總黃酮質量分數按照公式(1)計算，對照品、供試品的HPLC色譜圖見圖1。

w(總黃酮)=[w(槲皮素)+w(山奈酚)+w(異鼠李素)]×2.51。

(1)

圖1 對照品、供試品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the reference and test samples

2.2 大孔樹脂的篩選

2.2.1 靜態吸附實驗

采用靜態吸附法考察4種型號大孔樹脂對銀杏葉總黃酮的吸附和解吸效果。選取經過預處理 D101、LX-5、AB-8、LX-158這4種大孔樹脂，抽濾，各稱取10 g，分別置于150 mL錐形瓶中。分別加入質量濃度為3 mg/mL銀杏葉粗提物溶液50 mL，室溫震蕩吸附24 h，使大孔樹脂吸附飽和，過濾，取出大孔樹脂備用，取濾液測定總黃酮質量分數[11-12]。

2.2.2 靜態洗脫實驗

將過濾后的大孔樹脂置于150 mL錐形瓶內，用蒸餾水沖洗除雜，并吸干表面水分，加入70%乙醇50 mL，室溫震蕩洗脫24 h后，過濾，取濾液測定總黃酮質量分數[11-12]。計算不同類型大孔樹脂的吸附率與解吸率。結果見圖2。由圖2可知，與其他類型大孔樹脂相比，LX-158對于銀杏葉總黃酮的吸附率和解吸率較高，因此，選用LX-158進行實驗。

圖2 不同類型大孔樹脂對銀杏葉總黃酮的吸附率與解吸率Fig.2 The adsorption and desorption rates of different types of macroporous resins for total flavonoids extracted from Ginkgo biloba

2.3 單因素試驗

采用單因素分析法，分別考察上樣濃度、洗脫劑乙醇體積分數、洗脫液接收體積和洗脫流速對銀杏葉總黃酮柱層析效果的影響。分別設置上樣質量濃度為2、3、4、5 mg/mL，乙醇體積分數為50%、60%、70%、80%，洗脫液接收體積為1、2、3、4 BV，洗脫流速為1、2、3、4 BV/h，其他變量按照洗脫劑乙醇體積分數為70%，洗脫流速為2 BV/h，洗脫液接收體積為2 BV，上樣質量濃度為3 mg/mL進行實驗。

由圖3可知，隨著上樣質量濃度的增大，銀杏葉總黃酮質量分數和收率先增加后降低；隨著乙醇體積分數的增大，總黃酮質量分數先增加后降低，而收率一直增加；隨著接收體積的增加，總黃酮質量分數先增加后降低，收率一直增加，隨著洗脫流速的增加，總黃酮質量分數及收率先增加后降低。因此分別選擇上樣質量濃度2、3、4 mg/mL，乙醇體積分數60%、70%、80%，接收體積為1、2、3 BV，洗脫流速為1、2、3 BV/h進行后續響應面法優化實驗，考察對柱層析效果的影響。

圖3 不同因素對銀杏葉總黃酮柱層析效果的影響Fig.3 The effect of different factors on the column chromatographic purification of total flavonoids from Ginkgo biloba

圖3(續)

2.4 響應面工藝優化分析

BBD響應面法是一種優化多變量系統的實驗設計方法，可通過多元二次回歸方程擬合多個因素與多個響應值之間的函數關系，通過回歸方程數學模型尋求最佳條件和參數，從而獲得較為精確的最佳工藝參數和響應目標的最優值[13]。近年來，該方法已經被廣泛應用于中藥及復方有效成分的提取純化工藝的優化中。

2.4.1 評價指標

在單因素試驗的基礎上，根據BBD響應面法設計原理，以銀杏葉總黃酮質量分數(R1)、收率(R2)及二者綜合評分(R綜)為響應值，以上樣質量濃度(A)、洗脫劑乙醇體積分數(B)、洗脫液接收體積(C)及洗脫流速(D)為考察因素，其變化水平如2.3節所述，考察對銀杏葉總黃酮柱層析純化工藝的影響。因為總黃酮質量分數和收率具有相關性，總黃酮質量分數增大會導致其收率的降低，反之亦然。在保證銀杏葉總黃酮質量分數的前提下，為了盡可能提高其收率，所以選擇銀杏葉總黃酮質量分數(R1)、收率(R2)權重系數分別為60%、40%，R綜計算如式(2)所示。

R綜=(R1/R1max×60%+R2/R2max×40%)×100。

(2)

2.4.2 實驗結果

BBD響應面優化柱層析工藝設計方案及結果見OSID科學數據與內容附表，二次回歸方程方差分析如表1所示。

表1 BBD響應面優化柱層析工藝二次回歸方程方差分析

表1(續)

利用Design-Expert V8.0.6軟件對表1中的數據進行二次多元回歸擬合，R綜對各因素的二次多項回歸模型方程為R綜=-687.44+60.03A+18.12B+30.43C+24.12D-0.11AB-0.16AC+0.56AD+0.13BC+0.035BD-1.39CD-8.47A2-0.13B2-9.05C2-6.49D2，R2=0.992 6。

回歸擬合結果分析可知，對銀杏葉總黃酮質量分數R1，收率R2來說，回歸模型P<0.01，說明回歸模型極顯著，模型成立；失擬項P>0.05，說明失擬項影響差異無統計學意義，提示回歸方程擬合度良好。本實驗以R綜為綜合評價指標，對于R綜來說，回歸模型P<0.01，說明回歸模型極顯著，模型成立；A、B、A2、B2、C2、D2因素P<0.01，交互項AB、BC、CD的P<0.05，差異具有統計學意義。

2.4.3 響應面模型分析

利用Design-Expert V8.0.6軟件得到二次回歸方程的響應面圖，以此評價實驗各因素之間的交互強度，以確定最佳純化工藝參數。交互項AB、BC、CD等高線圖與3D響應面圖見圖4。

圖4 各因素交互作用對綜合評分R綜的影響Fig.4 The influence of the interaction of various factors on the comprehensive score Rcomprehensive

圖4(續)

等高線越接近橢圓形或響應面線越陡峭說明這兩種交互因素對響應值影響越顯著，反之不顯著。由圖4(a)可知，綜合評分R綜隨著上樣質量濃度與乙醇體積分數的增加而逐漸增大，當到達最大值后逐漸減小。由等高線形狀可知，上樣質量濃度與乙醇體積分數兩因素交互作用較強，對R綜影響較顯著，且上樣質量濃度對R綜的影響大于乙醇體積分數對R綜的影響。由圖4(b)可知，綜合評分R綜隨著接收體積與乙醇體積分數的增加而逐漸增大，當達到最大值后逐漸減小。由等高線的形狀可知，接收體積與乙醇體積分數兩因素交互作用較強，對R綜影響較顯著，且乙醇體積分數對R綜的影響大于接收體積對R綜的影響。由圖4(c)可知，綜合評分R綜隨著洗脫流速與接收體積的增加而逐漸增大，當達到最大值后逐漸減小。由等高線的形狀可知，洗脫流速與接收體積兩因素交互作用較強，對R綜影響較顯著,且洗脫流速對R綜的影響大于接收體積對R綜的影響。

由響應面實驗得到，各因素對R綜值的影響從大到小排序為：上樣質量濃度，洗脫劑乙醇體積分數，洗脫流速，洗脫液接收體積。且交互項上樣質量濃度與洗脫劑乙醇體積分數，洗脫劑乙醇體積分數與洗脫液接收體積，洗脫劑接收體積與洗脫流速對R綜值影響顯著。

利用Design-Expert v8.0.6軟件優化得到最佳柱層析純化工藝：上樣質量濃度為3.13 mg/mL，洗脫劑乙醇體積分數為71.06%，洗脫液接收體積2.08 BV及洗脫流速為2 BV/h。

2.5 驗證實驗

結合實際所需，最終確定柱層析純化工藝：上樣質量濃度為3.1 mg/mL，洗脫劑乙醇體積分數為71%，洗脫液接收體積2 BV及洗脫流速為2 BV/h。按照上述柱層析純化工藝，完成3批驗證實驗。實驗結果為銀杏葉提取物中總黃酮的平均質量分數可達到35.77%，收率為93.30%，RSD(相對標準偏差)分別為1.21%、2.30%；R綜平均值為98.45，預測值為98.62，R綜實測值與預測值基本一致；且銀杏總內酯質量分數達到《中國藥典》標準，證明驗證實驗具有可行性。

3 結論

本實驗在單因素試驗基礎上，利用BBD響應面法進行多組實驗的設計優化，實現對多個因素多個水平的綜合考察，得到最佳的工藝條件[14-15]。最佳柱層析純化工藝為上樣質量濃度為3.1 mg/mL，洗脫劑乙醇體積分數71%，洗脫液接收體積2 BV及洗脫流速為2 BV/h 。經驗證，銀杏葉提取物中總黃酮的平均質量分數可達到35.77%，收率為93.30%，R綜平均值為98.45。本研究優化得到的最佳柱層析純化工藝能盡可能地減少雜質，大大提高銀杏葉總黃酮質量分數，且銀杏葉總黃酮、總內酯的質量分數均達到《中國藥典》的標準，為大生產制成各種制劑提供原料藥作參考。