活細胞轉錄組測序技術 微創(chuàng)提取即可看清細胞“前世今生”

文／刁雯蕙 劉傳書

細胞是生命的基本單位，了解它的過去、現(xiàn)在和未來不僅有助于我們了解正常的發(fā)育過程，也對理解疾病的產(chǎn)生和發(fā)展至關重要。然而，想要看清細胞的“前世今生”仍然面臨很大的技術困難。

8月17日，中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所研究員陳萬澤以共同第一作者身份在國際頂級期刊《自然》雜志上發(fā)表長文，介紹了他們研究團隊在國際首創(chuàng)的活細胞轉錄組測序技術（Live-seq），該技術首次讓單細胞進行轉錄測序后，依然能保持細胞存活，首次實現(xiàn)了活細胞全基因表達的連續(xù)觀測。

“該研究實現(xiàn)了使用活細胞轉錄組測序技術對同一個活細胞多次分離部分細胞質進行多次轉錄組測序，表明這一技術有望在將來用于構建單個活細胞的轉錄組系列變化動態(tài)模型。該研究為單細胞轉錄組測序提供了全新的研究策略，為我們理解生命過程的動態(tài)變化提供了強有力的手段，是這一領域的又一重大突破。”北京大學生命科學學院教授湯富酬評論道。

不殺死細胞就能進行測序

為什么人類體內的細胞擁有的基因組幾乎一樣，但是每個人卻各不相同呢？基因組中數(shù)萬個基因表達與否和表達程度高低，很大程度上決定了細胞的種類和功能。

因此，如果知道細胞不同時間的基因表達的變化，就能夠了解細胞的過去、現(xiàn)在和未來。

當前，單細胞轉錄組測序技術是了解細胞狀態(tài)的重要手段，通過單細胞轉錄組測序能夠看清細胞現(xiàn)在所有基因的表達狀態(tài)。但是該技術在理解細胞的動態(tài)變化方面卻面臨很大挑戰(zhàn)。

“利用單細胞轉錄組測序技術來觀測細胞狀態(tài)的前提，是需要將細胞裂解，提取其中的RNA來測定每個基因表達量的高低，但這樣就不可避免地殺死了細胞。”陳萬澤說道，“使用單細胞轉錄組測序技術，也只能了解到一個細胞當下的狀態(tài)，卻不能了解它的過去，也無法知曉它將來的功能。”

通過近7年的努力，陳萬澤與合作者開發(fā)了活細胞轉錄組測序技術，其核心是通過對活細胞中的部分細胞質進行微創(chuàng)提取，并對極其微量的細胞質RNA進行擴增，實現(xiàn)在進行單細胞轉錄組測序后，依舊保持細胞的存活和功能，從而可以跟蹤細胞的動態(tài)變化。

論文通訊作者、瑞士洛桑聯(lián)邦理工學院教授巴特·普朗克（Bart Deplancke）表示，該技術兼具全基因表達分辨率和動態(tài)解析能力，是目前對單細胞轉錄組直接動態(tài)測量、偶聯(lián)細胞現(xiàn)有狀態(tài)和其后續(xù)表型的唯一解決方案。

歷經(jīng)兩次碰壁終于“吸”出RNA

如何在不殺死細胞的前提下，看到細胞的動態(tài)變化？

“我們首先想到的是外泌體，它是細胞向外面吐出來的小泡，里面有蛋白質、RNA等物質。如果我們把單個細胞的外泌體都收集起來，再對其中的RNA進行測量，或許就可以在一定程度上反映細胞狀態(tài)而又不殺死細胞。”陳萬澤說道。

單個細胞中僅有10皮克的RNA，這相當于一克的一千億分之一的重量，而細胞分泌的外泌體中的RNA更是少之又少。研究團隊設計了一種微流控技術用以完成單細胞捕獲、外泌體收集等，但他們發(fā)現(xiàn)由于外泌體中的RNA數(shù)量太少，根本無法實現(xiàn)單細胞分子水平的觀測。

隨后，陳萬澤嘗試利用在生命科學領域非常小眾的原子力顯微鏡來獲取細胞中的RNA。它有一個很尖的硅探針，多用來檢測物質表面性質。研究團隊通過對探針進行表面活化、修飾、洗脫等改造，讓其能夠把細胞中的RNA“釣”出來。

“這種探針很細，對細胞的損傷很小，就像魚鉤一樣，改造后可以把細胞中的RNA‘釣’出來，并能保證細胞繼續(xù)存活。我們改造了數(shù)十個探針后，結果只在兩個細胞上成功‘釣’到了RNA。”陳萬澤回憶道，當時購買一個原子力顯微鏡探針需要800美元，研究成本太高，成功率太低，這種情況讓這項研究再次面臨阻礙。

在一次偶然的學術交流中，陳萬澤與導師了解到，瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學院的朱麗亞·沃爾特（Julia Vorholt）實驗室開發(fā)了一種特殊的原子力顯微鏡，能夠吸出一部分細胞質。

一番交流后，陳萬澤團隊與朱麗亞·沃爾特實驗室一拍即合，展開了聯(lián)合攻關。聯(lián)合團隊對一系列的實驗過程進行了優(yōu)化，解決了RNA降解、低溫下的快速操作、超微量樣品轉移、采樣通道清洗避免交叉污染、圖像下追蹤細胞等多個問題，保證了實驗結果的可靠性。

聯(lián)合團隊利用重新改造后的活細胞轉錄組測序技術，對5種類型共295個細胞進行了測序，發(fā)現(xiàn)該技術能夠有效區(qū)分不同類型的細胞，且平均每個細胞能檢測到約4112個基因的表達信息。

僅對少量的細胞質進行測序，是否就能代表細胞的狀態(tài)？

“我們平行比較了單細胞轉錄組測序結果，發(fā)現(xiàn)活細胞轉錄組測序結果與普通的單細胞轉錄組測序結果高度吻合，證明活細胞轉錄組測序技術能夠很好地體現(xiàn)細胞的全轉錄組狀態(tài)。”陳萬澤說道。

細胞的存活率又如何保證呢？

“這種特殊的原子力顯微鏡探針尖端只有幾百個納米大小，對細胞損傷極小。吸取約5%—50%的細胞質后，細胞體積可以快速恢復到正常水平，存活率為85%—89%，細胞能進行正常分裂。通過一系列的功能分析和分子表征，我們沒有發(fā)現(xiàn)活細胞轉錄組測序技術對細胞的狀態(tài)有顯著的影響。”陳萬澤表示。

對此，審稿人在評審意見中也寫道：“由于細胞測序后仍舊存活，活細胞轉錄組測序技術首次實現(xiàn)了對同一個細胞全基因表達的連續(xù)測量。”

細胞測序結果從“高清圖片”到“高清電影”

在細胞觀測技術史上，顯微成像和基因編輯介導的分子記錄等技術不僅能觀察細胞的生長、分裂、死亡等過程，還能觀測細胞中的單個或幾個基因指標。

2009年，單細胞轉錄組測序技術為更系統(tǒng)全面地定義細胞類型和狀態(tài)提供了變革性手段。但人們仍然只能觀察到細胞的靜態(tài)狀態(tài)，無法連續(xù)觀測細胞的動態(tài)或者檢查細胞后續(xù)的表型。

如果將利用單細胞轉錄組測序技術觀測細胞，比喻為看一張細胞在分子水平的高清圖片，那么利用活細胞轉錄組測序技術觀測細胞，就好比看一部細胞的高清電影，能夠看見它的“前世今生”。

“活細胞轉錄組測序技術可以回答細胞怎樣的過去決定了它的現(xiàn)在，不僅知道細胞為何存在差異，還知道這些差異從何而來。”陳萬澤介紹。

在驗證實驗中，研究團隊利用活細胞轉錄組測序技術直接測定了同一個巨噬細胞在不同時間的狀態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)細胞起始狀態(tài)的少數(shù)基因的表達差異和噪音（如Nfkbia、Gsn等）是決定細胞后續(xù)反應差異的重要原因。然而，普通的單細胞轉錄組測序技術無法找到這些規(guī)律。

陳萬澤表示，盡管活細胞轉錄組測序技術仍然存在諸多挑戰(zhàn)，需要進一步完善，比如低通量、暫不能在體內應用、在高度極化且mRNA分布不均的細胞中無法實現(xiàn)全細胞轉錄組測序、對細胞更多次的采樣還需進一步研究等，但該技術首次實現(xiàn)了活細胞連續(xù)觀測，也為單細胞測序技術發(fā)展帶來了更多可能性。未來，團隊將進一步進行深入研究，提高活細胞轉錄組測序技術的可用性。