富硒培養對羊肚菌母種菌絲生長的影響

朱金霞 馮 銳 任怡蓮

（1.寧夏農林科學院農業生物技術研究中心，寧夏農業生物技術重點實驗室，寧夏 銀川 750002；2.寧夏農林科學院農業經濟與信息技術研究所，寧夏 銀川 750002；3.寧夏農林科學院，寧夏 銀川 750002）

羊肚菌隸屬子囊菌門、盤菌綱、盤菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬（Morchella），因其菌蓋呈褶皺網狀似羊肚而得名，在民間也被稱為陽雀菌、狼肚菌、麻子菌、天狼肚、包谷菌兒、編笠菌、雞蛋花等[1]。羊肚菌味道鮮美，含有鐵、鋅等礦質元素，24.5%蛋白質，19 種氨基酸[2]，還含有羊肚菌酸、多糖、甾醇等特征成分[3]，具有“菌中之王”的美譽，廣受歐洲、美洲、東亞、東南亞一些國家歡迎。

據《本草綱目》記載，羊肚菌性平，味甘寒，有益腸胃、助消化、化痰理氣、補腎壯陽、補腦提神等功效[4]。現代醫學研究表明，羊肚菌能降血脂、調節免疫、抗疲勞、抗病毒、抗菌、抑制腫瘤和減輕放化療引起的毒副作用等[2,3]。隨著社會經濟的發展和人們對羊肚菌營養和保健價值認知的加深，對于羊肚菌的需求也會越來越大，生產高品質的羊肚菌既符合當代消費者的需求，也是羊肚菌產業發展的重要契機。

硒是人類生命活動必需的微量元素之一，人體適量攝入硒元素能預防細胞癌變、減緩衰老、增強免疫力和解毒排毒等，嚴重缺硒會誘發大骨節病、克山病、呆小癥等病癥[5]。現代醫學表明，威脅人類健康和生命的疾病中有四十多種與缺硒有關[6]。由于人體不能自身合成硒，所以硒的營養水平主要來源于日常飲食，而土壤或栽培料又是植物硒的主要來源[7]。

中國是全球嚴重缺硒的地區之一，低硒地區占全國的72%，部分地區嚴重缺硒[5]，外源添加硒元素是提高作物硒含量的重要途徑。自然界中硒主要以有機硒和無機硒的形態存在，人類需要的是有機硒[5]，而納米硒粒徑較小，比表面積大，表面活性高，易被腸道吸收，具有較高的生物利用率。此外，納米硒急性毒性顯著低于亞硒酸鈉，比常用的硒化物的安全劑量范圍更廣[8]。

食用菌是良好的硒生物轉化載體，能夠將環境中的無機硒轉化為安全高效的有機硒[9]，開展食用菌富硒栽培，能夠將食用菌和硒元素的功能有機融合，研制富硒的食品或藥品，對于食品、保健和醫藥領域都具有重要意義[10,11]。而食藥用菌中所積累的微量元素含量與生長環境類型、食藥用菌種類、元素類型有關，生長環境中過量的硒元素會阻礙菌絲生長和子實體形成[12,13]。

本研究在總結前人工作的基礎上，以改良PDA培養基為基礎培養基（對照），比較培養基不同納米硒添加量對羊肚菌母種菌絲生長的影響，以篩選出羊肚菌母種菌絲富硒培養最適的納米硒添加量，為羊肚菌母種菌絲的富硒馴化培養和菌種制作提供理論基礎和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

（1）菌種。供試羊肚菌品種為六妹羊肚菌（Morchella sextelata），由寧夏農林科學院農業生物技術研究中心微生物與酶工程研究室經子實體組織分離、培養和純化后獲得，4 ℃保存于試管中。

（2）羊肚菌母種培養基制備。基礎培養基為改良PDA 培養基（T0），制作方法：馬鈴薯（去皮、切條）250 g，加蒸餾水約1 000 mL 加熱至沸騰，小火煮沸15 min，4 層紗布過濾。濾液中添加葡萄糖30.0 g、KH2PO42.5 g、MgSO42.0 g、蛋白胨2.0 g、瓊脂15.0 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，分裝。富硒母種培養基制備方法：在分裝后的基礎培養基中加入納米硒，121 ℃滅菌30 min 后制作平板。納米硒添加量設置7 個水平，分別為0.052、0.104、0.208、0.416、0.832、1.664 和3.328 mg/L，編號T1～T7。每個水平重復6 次。

1.2 菌種活化方法

在基礎培養基平板中央接入羊肚菌試管種，在12±1 ℃條件下暗培養5 天，備用。

1.3 菌落長勢調查方法

在無菌條件下，活化的羊肚菌平板種打孔制成直徑10.0 mm 菌餅，分別接種至不同納米硒添加量的平板中央，在12±1 ℃下暗培養。接種后第3 天開始用游標卡尺測量菌落直徑（mm），至培養第10 天時結束實驗。

1.4 數據處理

利用Excel 軟件進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 不同納米硒添加量的羊肚菌菌落直徑

由圖1 可知，培養基中納米硒添加量對羊肚菌菌落直徑影響顯著，菌落直徑隨培養基中納米硒添加量的增加呈先增大后減小的趨勢。納米硒添加量為0.104 mg/L（T2）時，菌落直徑最大。在接種后第3～6 天，T2 處理菌落直徑分別可達35.1 mm、48.6 mm、62.7 mm 和77.2 mm，比未添加納米硒的對照T0 大23.17%、19.93%、18.99%和15.16%。

圖1 不同處理的羊肚菌菌落直徑變化

培養基中納米硒添加量為0.416 mg/L（T4）時，菌落直徑與T0（CK）比較差異不顯著（P>0.05）。隨著培養基中納米硒添加量的增大，當硒添加量≥0.832 mg/L（T5）時，菌落直徑顯著小于對照（P<0.05），往后硒添加量越大，菌落直徑越小。

由表1 可知，母種培養基中納米硒添加量對羊肚菌菌落直徑日均增長量具有顯著影響。菌落直徑日均增長量，除T0（CK）處理隨培養時間增加呈先增大后減小的趨勢外，其他處理均呈增大趨勢。各處理菌落直徑日均增量最大值出現時間，T0（CK）為第4 天，而添加納米硒的其他處理均為第6 天。

表1 不同處理羊肚菌菌落直徑日平均增長量（單位：mm）

2.2 不同處理羊肚菌菌絲體的形態特征

由圖2 可看出，培養基中納米硒添加量為0～3.328 mg/L 時（T0～T7），羊肚菌菌絲均能生長，但各處理間形態差異明顯。在接種后第10 天，T0～T5 處理的菌絲均已長滿平板，以T2 處理的菌絲體長勢最旺，密度最大。T7 處理雖然菌絲體密度大，但長速慢、長勢弱，可見，培養基中硒添加量過大，對羊肚菌菌絲體生長具有顯著抑制作用。

圖2 不同富硒處理羊肚菌菌絲體形態特征（第10 天）

3 討論與結論

天然食用菌中硒含量普遍偏低[14]，食用菌具有一定的富硒功能，外源添加硒元素是提高食用菌硒含量的重要方法，目前已經培育出的富硒食用菌種類有靈芝、金針菇、平菇、香菇和猴頭菌等[9,10]。羊肚菌具有較強的富硒能力，能通過生物吸附及細胞內生化作用吸收無機硒，并與大分子活性物質結合，最終以硒蛋白或硒多糖等形式存在[15]。羊肚菌菌絲體富硒培養相比于常規培養，其菌絲體多糖具有更高的體外抗氧化作用[16]，且菌絲體兼具硒的生物活性，價值更高。

隨著富硒食用菌優勢的逐漸顯現，其價值漸被認可，隨著富硒食用菌優勢的逐漸顯現，其價值漸被認可，相關研究增多。如有學者研究表明，低濃度的亞硒酸鈉對靈芝菌絲具有促進作用，靈芝斜面培養基培養時最佳亞硒酸鈉濃度為0.05 g/L[17]；白靈菇母種培養基和培養料中添加40～80 mg/kg 亞硒酸鈉能提高菌種質量，促進菌絲生長，提高子實體富硒能力和產量[18]。

現階段關于富硒羊肚菌的研究主要集中在菌絲體發酵培養階段，且菌株間存在較大差異。李娟[19]報道泰山羊肚菌液體培養最適硒離子濃度為200 mg/kg，此時菌絲體有機硒含量比對照提高145 倍。冮潔等[20]報道，羊肚菌液體培養的適宜亞硒酸鈉濃度為10 mg/L。張躍非[16]研究發現，亞硒酸鈉濃度為9 g/L 時羊肚菌菌絲體生物量最高，超過11 g/L時菌絲體生物量有所下降，但在5 g/L 時，菌絲體富硒率高于生物量最高時的富硒率。

本研究結果表明，母種培養基中，納米硒添加量低于0.416 mg/L 時，六妹羊肚菌菌絲能夠正常生長；添加量≥0.832 mg/L 時，則呈現出顯著的抑制作用；添加量為0.104 mg/L 時，菌絲生長快而旺盛，菌絲體密度大，是六妹羊肚菌母種培養基的最佳納米硒添加量。