豬卵巢在4℃條件下不同保存時間對卵母細胞體外成熟質量的影響

蘭可心 ，張學煒 ，鄭璐璐 ，王 敏 ，崔茂盛

（1.天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 300380；2.天津市農業科學院畜牧獸醫研究所，天津 300381）

近年來，隨著胚胎工程相關技術研究和應用的不斷發展，研究者越來越需要數量更多的高質量卵母細胞以滿足試驗和科研需求。早期研究已表明，卵巢在其保存運輸過程中的質量對卵母細胞成熟和后期發育潛力具有重要影響。目前獲取卵巢的方式主要有體內和體外兩種，體內獲取操作復雜、成本高、耗時長、成功率低，而體外獲取主要是從屠宰場收集卵巢，該方法操作簡單、成本低、速度快、數量足。因此，體外卵巢已經成為科研人員開展胚胎工程相關研究的主要獲取方式。現實情況下，運輸距離遠、生豬養殖和屠宰區域限制等等原因往往導致卵巢從離體到送達實驗室時間較長，這對卵巢保存技術提出了更高要求。Matías Nicolás Tellado、Pim Pra Par等報道，豬卵巢35℃保存條件下，隨著保存時間延長，卵泡液會因微環境酸化引起卵母細胞中毒，對體外成熟卵母細胞的氧化狀態和體外受精胚胎發育能力造成負面影響。Kamoshita K等將小鼠卵巢在不同溫度下保存24 h發現，保存在4℃條件下的卵巢組織結構異常變化率顯著低于保存在14℃和37℃條件下的卵巢。上述前人實驗表明，卵巢在體外保存過程中，不同溫度對卵巢保存效果具有較大影響，并進一步影響著卵泡質量和卵母細胞成熟及發育潛力。

然而，目前有關卵巢保存技術的研究報道不多，特別是不同溫度下對豬卵巢保存效果的探討。本研究綜合運用免疫熒光染色、酶聯免疫吸附試驗和基因表達技術，深入探討了4℃下不同保存時間對豬卵母細胞成熟質量及發育潛力的影響。本研究結果對卵巢體外保存相關技術的理論研究和實踐操作均具有重要的指導意義。

1 材料和方法

1.1 實驗設計

本實驗所用卵巢從屠宰場獲取，設計了卵巢在4℃條件下保存6 h、18 h和24 h對卵巢內卵母細胞成熟質量、氧化凋亡水平及相關基因mRNA表達水平的影響。本實驗以0 h為對照組，每組實驗均重復3次。

1.2 試劑和藥品

M199（美國Gibco公司）；1×PBS（SolarBio）；DNA/RNA提取試劑盒（TACO）；mRNA反轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒（TAKARA)；無特殊說明的情況下，細胞培養所需其他試劑均購自Sigma公司。

1.3 卵母細胞收集、體外成熟和孤雌培養

卵巢取自天津市某屠宰場，置于37℃裝有0.9%NaCl溶液（含青鏈霉素）的保溫瓶中，并于2 h內運到實驗室。用含0.1%青鏈霉素的PBS溶液清洗3～5次后放置到4℃恒溫箱中避光保存。每組15個卵巢，分別在保存0 h（對照組）、6 h、18 h和24 h后各取出3個卵巢用于以下實驗研究。使用10 mL注射器，從卵巢表面抽取卵泡直徑大小為3.0～8.0 mm的透明卵泡。在體視顯微鏡下，使用口吸管挑出包裹3層以上卵丘細胞的卵母細胞，放置于四孔板中，在39℃、5%CO2、完全濕度培養箱中進行成熟培養44 h。44 h后使用透明質酸酶脫掉透明帶外的卵母細胞，放入1 mm寬的激活儀融合槽，使用激活參數105V-30us-1次脈沖進行激活。激活完成后移入PZM-3發育液進行后續孤雌發育。

1.4 豬卵母細胞卵丘擴展

體外培養44 h成熟后，使用倒置熒光顯微鏡（日本，Nikon）觀察并拍照COCs，檢測分析卵丘擴展指數。卵丘擴展指數（Cumulus Expansion Index，CEI）標準如下：0級：擴展不連續；1級：擴展1-2層；2級：呈放射狀，外層約一半擴展；3級：除放射冠外全部擴展；4級：全部擴展；CEI=（0級COCs個數×0＋1級COCs個數×1＋2級COCs個數×2＋3級COCs個數×3＋4級COCs個數×4）總COCs個數。

1.5 卵母細胞ROS及DNA片段化水平檢測

將脫去卵丘細胞的卵母細胞在0.1%PVA-PBS液中清洗3次后，進行如下染色試驗。 1）活性氧染色：卵母細胞在含有2′7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯熒光探針（碧云天，S0033S，1∶1 000）的0.1%PVA-PBS中于37℃條件下避光孵育15 min。然后在倒置熒光顯微鏡下選擇激發波長為488 nm，發射波長為525 nm的濾光片定性觀察胞質內活性氧含量。2）DNA片段化檢測：采用原位末端轉移酶標記技術進行檢測（碧云天，C1086）；操作步驟：a.4%多聚甲醛室溫固定30 min，b.0.3%Triton X-100室溫通透5 min，c.熒光染液（熒光標記液∶TdT酶=9∶1）37℃孵育60 min。孵育結束后用0.1%PVA-PBS充分去除多余染液，壓片。在倒置熒光顯微鏡下拍照，激發波長范圍為450～500 nm，發射波長范圍為515～565 nm（綠色熒光），實驗全程避光。

1.6 卵丘細胞總抗氧化能力及脂質氧化水平檢測

將挑出卵母細胞的卵丘細胞離心后，進行如下實驗?？偪寡趸芰z測：將卵丘細胞在冰浴充分震蕩裂解，通過測定Fe3+還原能力來測定（Solarbio，BC1315）。按照試劑盒說明配置標準溶液。樣品測定管：混合液180 μL、蒸餾水18 μL、細胞上清液6 μL。設置空白孔，室溫反應10 min，放置酶標儀內，測定593 nm時的吸光值。脂質氧化水平檢測：通過丙二醛（MDA）含量來反應脂質氧化水平（Solarbio，BC0025）。樣品檢測工作液配制：依次加入300 μL檢測工作液、100 μL樣本和100 μL試劑三。100℃水浴鍋孵育60 min后，立即放置冰盒上降至常溫。10 000 g，離心10 min。取上清200 μL放置96孔板中，測定在532 nm和600 nm的吸光度。每組樣本重復3次。

1.7 卵丘卵母細胞復合體（COCs）基因mRNA表達水平

采用RT-qPCR技術，分析各組抗氧化基因（NRF-2、CAT、SOD）、凋亡基因（BAX）、抗凋亡基因（Bcl-2）、縫隙連接蛋白基因（CX37、CX 43、CX 45）的mRNA表達水平。引物序列見表1。使用全自動核酸提取試劑盒（TACO）提取COCs內總RNA，將1 000 ng總RNA反轉錄成cDNA。RT-qPCR反應設置95℃預變性3 min，95℃變性15 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s（39個循環），最后72℃延伸5 min，每個樣品每次設3個復孔。內參基因為GAPDH。

表1 引物序列

1.8 統計分析

ROS水平及DNA片段化水平用熒光顯微鏡拍照片后使用Image J 180分析熒光強度。目的基因相對表達水平采用2-ΔΔct法計算。所有數據應用SPSS 25.0統計軟件進行單因素ANOVA 分析，所有數據以平均值±標準誤表示。P＜0.05 表示差異顯著。使用Graphpad Prism 9軟件繪圖。

2 結果分析

2.1 豬卵巢于4℃保存后對卵母細胞發育能力的影響

4℃保存豬卵巢對卵母細胞成熟及發育潛力如表2所示。

表2 4℃保存豬卵巢對卵母細胞成熟及發育潛力

表2總結了在4℃保存豬卵巢0 h、6 h、18 h及24 h后，體外成熟44 h對卵母細胞存活率及成熟率的影響。與對照組（0 h）相比，當保存時間延長到6 h、18 h及24 h后其存活率及成熟率均顯著降低。隨著時間增加，未經過保存0 h組的存活率及成熟率均顯著高于6 h組（96.51±0.07vs38.44±4.54；68.78±3.15vs6.00±1.76；P＜0.05），且前兩組也均高于18 h組和24 h組（26.89±2.78vs14.67±1.33；0.00±0.00vs0.00±0.00；P＜0.05）。各組之間存活率差異性顯著，而18 h組和24 h組成熟率無顯著差異（0.00±0.00vs0.00±0.00）。

由表3可知，將成熟卵母細胞孤雌激活后記錄孤雌卵裂率及囊胚率。對照組孤雌卵裂率及囊胚率顯著高于實驗組（76.67±3.33），且隨著保存時間延長，各組卵裂率及囊胚率顯著降低。18 h組相對于6 h組卵裂率顯著降低（0.00±0.00vs3.33±3.33；P＜0.05），且與24 h組無顯著差異。6 h組囊胚率相對于對照組顯著降低（0.00±0.00vs26.67±3.33；P＜ 0.05），而與18 h和24 h組無顯著差異（0.00±0.00vs 0.00±0.00）。

表3 4℃保存豬卵巢對卵母細胞孤雌卵裂及囊胚數

2.2 豬卵巢于4℃保存對卵母細胞ROS含量及DNA片段化水平的影響

4℃保存對卵母細胞活性氧含量以及DNA片段化影響如圖1所示。

圖1 4℃保存對卵母細胞活性氧含量以及DNA片段化影響

使用免疫熒光染色來檢測卵母細胞內活性氧及DNA片段化水平，以此反應卵母細胞氧化和凋亡的程度?；钚匝鹾恳约癉NA片段化水平均隨著保存時間的延長逐漸升高。如圖2 A所示，0 h組、6 h組、18 h組及24 h組的活性氧含量均顯著升高（3.17±0.04vs9.06±0.41vs 11.99±0.36vs14.97±0.26；P＜0.05）。DNA片段化水平在0 h組、6 h組、18 h組顯著升高（0.09±0.07vs3.43±0.34vs 7.69±0.44；P＜0.05）。18 h組和24 h組之間無顯著差異（8.86±0.06，圖2B）。

2.3 豬卵巢于4℃對卵丘細胞擴展指數、總抗氧化能力和丙二醛含量的影響

豬卵巢于4℃對卵丘細胞擴展指數、總抗氧化能力和丙二醛含量的影響如圖2所示。

使用酶聯免疫檢測儀來檢測卵丘細胞內T-AOC及MDA含量，以此反應卵丘細胞總抗氧化能力和脂質氧化（MDA）的程度。如圖2A所示，活性氧含量以及DNA片段化水平均隨著保存時間的延長逐漸升高。0 h組、6 h組、18 h組及24 h組的脂質氧化含量均顯著升高（1.26±0.04 vs 1.26±0.04 vs 2.07±0.04vs2.20 ±0.01；P＜0.05）。相對于對照組，總抗氧化能力水平在6 h組、18 h組顯著升高（3.65±0.05vs2.53±0.02vs1.62±0.01；P＜0.05）。而18 h組和24 h組之間無顯著差異（1.52±0.00）。

圖2 A: 卵丘擴展指數 B: 總抗氧化能力 C: 丙二醛（MDA）含量

2.4 豬卵巢于4℃對卵丘卵母細胞復合體相關基因mRNA表達的影響

豬卵巢于4℃對卵丘卵母細胞復合體相關基因mRNA表達的影響如圖3所示。

使用RT-PCR測定相關基因表達量，如圖3所示，與對照組相比，抗氧化基因CAT、SOD、NRF-2（圖3，A）、抗凋亡基因Bcl-2（圖3，C）、縫隙鏈接蛋白CX37、CX45、CX43（圖3，B），隨著時間延長，表達顯著降低（P＜0.05）。而凋亡基因Bax表達量顯著上升（P＜0.05）。從Bcl-2/Bax比值可看出，隨著保存時間的延長逐漸降低，對照組顯著高于試驗組，而6 h組和18 h組相對24 h組顯著升高，而組間無顯著差異。

圖3 A:抗氧化基因CAT、SOD、NRF-2的基因表達。B: 縫隙鏈接蛋白CX37、CX45、CX43的基因表達。C: 抗凋亡基因Bcl-2和凋亡基因Bax的基因表達。D: Bcl-2/Bax比值

3 討論

隨著以胚胎工程為核心的現代生物技術研究與應用的發展，對高質量卵子的需求量越來越大。作為卵母細胞的儲備器官及生長發育的組織，卵巢的獲取與保存運輸也愈發重要。目前，國內外開展的胚胎生物工程相關研究所需的卵巢大多都從豬屠宰場獲得。理論上說，這些從屠宰場獲得的離體卵巢越早送達實驗室，從其中獲得的卵母細胞成熟質量和后期發育潛力也越高。開展離體卵巢長時間高質量保存相關技術研究，不僅可以為遠距離、長時間運輸卵巢提供技術支撐，也對動物種質資源保護具有重要意義。

大量文獻資料顯示，從屠宰場獲得卵巢最好在2～4 h內送達實驗室。然而，由于道路交通、屠宰場距離以及當地生豬養殖與屠宰政策等等因素，往往導致卵巢到達實驗室的時間較長。如果卵巢在運輸過程中保存不當，比如溫度過高、過低以及保存液pH變化等等，均可能造成保存過程中卵巢的一些異常變化，從而影響卵巢內卵母細胞的體外成熟質量和胚胎發育潛力。目前有關卵巢保存技術的研究不多，缺乏對豬卵巢保存過程中的影響因素及其作用機理的探討。

本研究較為系統地探討了將豬卵巢在4℃保存不同時間后對卵母細胞質量及卵丘細胞的氧化凋亡水平的影響，并從發育潛力、生化水平和相關抗氧化基因表達層面對其影響機理做了初步探討。大量實驗室使用4℃來用作器官低溫保存的選擇，低溫能有效地減少組織代謝以及缺血造成的損傷；卵巢在4℃下長期保存可能會改變體外成熟過程中參與調節卵母細胞抗氧化防御系統的其他酶的活性。需要進一步評估以提高對從冷藏卵巢中回收的卵母細胞的氧化還原狀態的認識。基于上述理論基礎，本研究選擇了4℃保存條件下，探討保存6 h、18 h和24 h對卵母細胞體外成熟、成熟質量以及胚胎發育潛力的影響。本研究結果顯示，隨著保存時間的不斷延長，本實驗中在4℃條件下保存的卵巢內卵母細胞的發育潛力、卵丘擴展、總抗氧化能力、抗氧化基因CAT、NRF-2、SOD、抗凋亡基因Bcl-2、和縫隙鏈接蛋白CX37、CX45、CX43的mRNA表達水平也隨之降低，凋亡基因Bax顯著升高，與保存時間成正相關。當保存時間達到6 h時，卵母細胞的存活率僅達到38.44%，而囊胚率僅為0%。有報道稱，豬卵巢離體后組織液的酸化是導致卵母細胞成熟質量低和后期發育能力差的原因之一。Luu Vien Viet等比較豬、牛、貓卵巢在4℃下貯藏5 d后的細胞核以及卵母細胞損傷的動力學變化，指出低溫保存顯著降低了成熟前的豬和牛生發囊泡期的卵母細胞的比例。當4℃下保存時間超過24 h后，沒有豬卵母細胞達到第一次減數分裂的中期，與本文的實驗結果較為一致。而也有一些不同的報道，如Anna Rita Piras等報道，家貓卵巢在4℃條件下保存24 h時，僅會降低部分卵巢腔前卵泡數量，隨著保存時間延長，卵巢內卵泡結構受損程度加重，并影響卵母細胞的氧化狀態及體外受精能力。在4℃保存條件下，該研究在家貓上的保存效果優于本研究在豬上的保存效果，這可能與不同物種細胞對溫度敏感性差異有關。有報道指出，豬卵母細胞，特別是種質細胞對低溫較為敏感，低溫變化更容易對豬卵母細胞和精子造成不可逆損傷。在不同動物上的研究結果也不盡一致，LinY-A等人對豬卵巢體外保存的研究結果表明，當保存時間為8 h，其最佳保存溫度約為25℃。而Alicia Martín-Maestro等認為，當綿羊卵巢在30℃保存超過7 h時，卵母細胞成熟質量及發育潛力均大幅度降低。但王鋒等報道卻指出，用接近牛體溫39℃溫度保存6 h可以維持正常代謝水平，對卵巢的保存更有利。

本實驗探討了卵巢在4℃保存條件下，保存時間為6 h、18 h及24 h時對豬卵巢內卵母細胞發育潛力及質量水平的影響。并從體外成熟能力、胚胎發育潛力、抗氧化水平以及相關基因表達水平等不同層面對影響機理做了初步探討。本文實驗結果表明，保存溫度對卵巢內卵母細胞質量有直接影響。當豬在4℃保存時間長于6 h時，卵母細胞質量嚴重下降。本實驗結果為后人開展卵巢保存相關研究提供了有益的理論和實踐指導。

4 結論

本文研究了解了卵巢儲存對未成熟卵母細胞生理特征的影響。結果已經證明，隨著保存時間的延長，在4℃保存豬卵巢對體外成熟的卵母細胞的氧化狀態及其發育能力產生負面影響，當保存時間達到6 h時成熟率及囊胚率顯著降低。這些結果為冷藏對腔前卵泡卵母細胞的影響提供了額外的信息。需要新的策略來評估保存或挽救儲存的卵母細胞發育潛力的可能性，以成功生產高質量胚胎。