家蠅漆酶2基因的克隆及序列特性與表達分析

吳書東， 黃蘭英， 彭 建， 國 果， 修江帆， 吳建偉， 尚小麗*

(1.貴州省感染免疫與抗體工程特色重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學 基礎醫學院 現代病原生物學特色重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.中南大學 湘雅醫院， 湖南 長沙 410008)

0 引言

【研究意義】我國是世界上秸稈產出量最多的國家之一，僅農作物秸稈的纖維產量高達2億t，對秸稈進行資源化利用的關鍵要素是對其所含木質纖維素的降解[1-2]。木質纖維素結構復雜，除了由纖維素和半纖維素組成的內部纖維絲外，還有木質素與半纖維素交聯在外部形成的保護屏障，從而嚴重阻礙木質纖維素的增值利用[3]。利用生物酶可針對性地破壞植物細胞壁，使得胞內的成分更容易降解，從而達到增加酶解糖化率的目的[4]。近年來，很多植食性昆蟲因可以高效利用富含纖維素的植物作為能量來源，被視為挖掘新型高效木質纖維素酶的重要研究對象[5]。家蠅(Muscadomestica)屬雙翅目(Diptera)蠅科(Muscidae)昆蟲，其蠅蛆食性雜，能夠通過生物降解多種有機廢棄物，包括酒糟、秸稈等[6-7]。實現此過程首先需要支撐固定作用的包裹纖維素和半纖維素的木質素水解[8]。漆酶(Laccase，Lac)屬多酚氧化酶，是木質素降解酶系重要成員之一，能夠降解木質素，使交聯其內的纖維素和半纖維素充分暴露并最終促進木質纖維素的整體降解[9]。因此，對家蠅漆酶展開研究意義重大。【前人研究進展】漆酶屬于木質素酶，是一種廣泛存在于植物、真菌、細菌和及昆蟲體內的含銅的多酚氧化酶[10]，來源不同的漆酶其功能不盡相同，其中，真菌產生的漆酶被認為是自然環境中木質素分解的重要環節之一[11]；植物源漆酶主要參與木質素的合成[12]、抗蟲、抗病[13]等；此外，現已有多種昆蟲均被證實含內源性漆酶，如煙草天蛾(Manducasexta)、岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)[14]、家蠶(Bombyxmori)[15]、果蠅(Drosophila)[16]、煙粉虱(Bemisiatabaci)[17]、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)[18]、松墨天牛(Monochamusalternatus)[19]等，不同種類的昆蟲其漆酶的組成不同，在昆蟲各組織器官的分布和功能存在差異。【研究切入點】貴州省感染免疫與抗體工程特色重點實驗室尚小麗副教授課題小組，前期通過對NCBI家蠅基因組數據庫進行分析，已篩選出被預測為家蠅漆酶基因的Lac基因，但尚未以家蠅漆酶為對象展開相關研究。【擬解決的關鍵問題】克隆家蠅漆酶并獲得完整的cDNA序列，通過生物信息學分析初步預測該cDNA序列的特性，進一步采用實時熒光定量PCR技術檢測漆酶2(Lac-2)基因在家蠅不同發育時期及家蠅3齡幼蟲脂肪體、唾液腺、前腸、中腸及后腸中的表達特征，為后續深入研究家蠅漆酶的生物學功能奠定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲 家蠅(Muscadomestica)于貴州醫科大學現代病原生物學特色重點實驗室傳代繁殖，溫度28℃，相對濕度70%，光照周期12L∶12D。

1.1.2 質粒與菌株 克隆質粒pMD19-T、感受態細胞E.coli-DH5α均購買于大連TaKaRa生物有限公司。

1.1.3 主要試劑 氯仿、異丙醇及無水乙醇等(成都金山試劑公司)，總RNA提取試劑TRIzol Reagent、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、瓊脂糖、溴化乙啶(EB)溶液及甘油(Glycerol，貴州凱信生物科技有限責任公司)，2×Prime Taq、DNA marker DL 2 000和DEPC水(Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 家蠅總RNA的提取及cDNA的合成 根據RNAiso PLUS 的步驟提取家蠅3齡幼蟲總RNA，通過電泳檢測和ND2000紫外分光光度計測定A260/A280的比值、濃度，選擇A260/A280為1.8～2.0的樣品，并以1 μg總RNA作為模板按Takara試劑盒說明書經兩步法合成cDNA。

1.2.2Lac-2基因的cDNA序列克隆與測序 根據NCBI家蠅全基因組數據庫篩選到家蠅Lac-2基因序列，以其cDNA序列為模板，使用DNA Club和Primer 5.0設計Lac-2基因cDNA序列的上下游克隆引物，引物序列為Lac-F，5’-ATGTCAGTCAAGTGGAAAATAAATGTGC-3’；Lac-R，5’-ACGGAATGTATTGCCCTGCTG-3’。以反轉錄合成的家蠅cDNA作為模板進行PCR反應，反應體系25 μL：2×Prime Taq 15 μL，上游和下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應程序：94℃預變性2 min；94℃變性40 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s，共30個循環；72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物，進行回收后與pMD19-T載體連接并轉化至E.coli-DH5α感受態細胞中，通過平板培養(含氨芐)，挑選單菌落進行PCR鑒定，并將初步鑒定正確的單菌落送往公司進行雙向測序，測序后比對得出Lac-2基因的全長cDNA序列。

1.2.3 家蠅Lac-2基因的生物信息學分析 以1.2.2所獲基因序列為對象，利用瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統(Expert Protein Analysis System，ExPASy，http: / /ca. expasy. org /)提供的生物信息學工具分析家蠅Lac基因的特點；運用NCBI Blast對基因序列進行同源比對，用ProtParam分析蛋白等電點、分子質量；用ProtScale分析蛋白質的疏水性；用SigalP-5.0進行信號肽預測；用PBIL中的SOPMA分析二級結構，Swiss-Model Workspace建模三維空間結構；用Mega-X中的鄰接法構建系統進化樹。

1.2.4 實時熒光定量PCR引物的設計與基因擴增 采用Primer 5. 0根據Lac-2的cDNA序列設計實時熒光定量PCR引物，以GAPDH為內參基因，引物序列如下：Lac-F，5’-TCCAGCTGATTGTGGTCCAA-3’；Lac-R，5’-TGGAAGGGATGCGACAAGT

T-3’；GAPDH-F，5’-GTCGTATTGGCCGTTTGGTT-3’；GAPDH-R，5’-GGGTGGAGTCGAATTTGAACA-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，59℃/60℃退火34 s，共40個循環；60℃延伸30 s。

1.2.5 不同發育階段及3齡幼蟲不同組織中Lac-2的表達分析 待qPCR反應結束后確認 Real Time PCR 的擴增曲線和融解曲線，收集數據進行統計學分析。確定特定熒光域值對應循環數的CT值，采用比較 2-△△CT法，對目標基因進行相對定量分析，采用SPSS 18.0進行統計學分析。不同發育階段的結果以卵期作為參照，不同組織的以脂肪體為參照進行分析。

2 結果與分析

2.1 家蠅Lac-2基因的PCR擴增

以家蠅cDNA為模板進行PCR擴增，得到的產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，Lac-2基因的全長cDNA序列的PCR產物大小為885 bp(圖1)，與預期的Lac基因片段大小(885 bp)相符。將目的基因回收后連接到pMD19-T，并對重組質粒進行測序，測序結果與NCBI數據庫已登錄序列一致，可用于下一步試驗。

注：M為DL2000 DNA Marker，1為陰性對照，2為Lac基因的擴增產物。

2.2 家蠅Lac-2基因的生物信息學特征

2.2.1 序列分析及系統進化樹構建 由圖2可見，對測序獲得的Lac-2基因的全長cDNA序列進行分析顯示，該基因序列長885 bp，編碼1個由294個氨基酸殘基組成的蛋白質。

注：圖中下劃線區域為信號肽。

2.2.2 序列比對 在NCBI蛋白質數據庫中進行氨基酸序列Blastp比對顯示，Lac-2具有Cu-oxidase_3這個典型的高度保守離子結構域，位于168～245位氨基酸(圖3)，進一步證明克隆的全長cDNA序列為漆酶基因，屬銅藍氧化酶蛋白家族。

圖 3 家蠅Lac-2基因的序列比對

2.2.3 編碼蛋白的理化性質 家蠅Lac-2成熟肽編碼蛋白的理論分子量為25 kDa，等電點為7.19。其成熟肽N端為纈氨酸時，家蠅Lac-2編碼蛋白在哺乳動物網狀紅細胞體外表達的半衰期為100 h，在酵母和大腸桿菌中表達的半衰期分別大于20 h和10 h。該蛋白不穩定指數為43.37，大于域值40，在溶液中性質不穩定，總平均親水性(GRAVY)-0.333，ProtScaler對家蠅Lac-2編碼蛋白的疏水性分析表明，家蠅Lac-2蛋白為親水蛋白(圖4)。

圖 4 家蠅Lac-2編碼蛋白的疏水性

2.2.4 信號肽位點 通過 SignalP-5.0 進行信號肽分析，家蠅Lac-2基因編碼蛋白具有信號肽，信號肽位置在第1～26位氨基酸(圖5)。

圖 5 家蠅Lac-2編碼的信號肽

2.2.5 二級結構 從圖6可知，家蠅Lac-2基因編碼蛋白的二級結構含有α-螺旋，11.90%；β-折疊，19.33%；β-轉角，7.06%；無規卷曲，61.71%。

圖 6 家蠅Lac-2編碼蛋白的二級結構

2.2.6 三級結構 如圖7所示，家蠅Lac-2蛋白含α-螺旋、β-折疊，并通過不規則卷曲相連。

圖 7 家蠅Lac-2編碼蛋白的三級結構

2.2.7 系統進化樹的構建 從包括家蠅Lac-2在內的20種昆蟲Lac基因編碼的氨基酸序列構建系統進化樹(圖8)可知，家蠅Lac-2與廄螫蠅(Stomoxyscalcitrans)的Lac-2(XP 013106835.1)、柑橘小實蠅(Bactroceradorsalis)的Lac-1(XP 011203333.1)及地中海實蠅(Ceratitiscapitata)的Lac-1(XP 004520735.2)的遺傳距離最小。

圖 8 昆蟲Lac基因系統發育樹

2.3 Lac-2基因在家蠅不同發育時期的表達

由圖9可見，以家蠅GAPDH為內參基因，以卵期作為參照，Lac-2基因在家蠅整個發育歷期呈先升高后降低趨勢，3齡幼蟲中Lac-2的表達量顯著升高(P<0.05)，各發育階段Lac-2表達量整體趨勢為3日齡幼蟲>蛹期>2日齡幼蟲>1日齡幼蟲>成蟲>卵。

注：圖柱上方不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)，下同。

2.4 Lac-2在家蠅3齡幼蟲不同組織中的表達

以家蠅GAPDH為內參基因，以脂肪體為參照，發現家蠅Lac-2基因主要在消化道中表達，其中，腸表達量顯著高于其他組織(P<0.05)，各組織Lac-2表達量為中腸>唾液腺>后腸>前腸>脂肪體(圖10)。

圖 10 家蠅Lac-2基因在3齡幼蟲不同組織的表達差異

3 討論

家蠅是一種分布廣泛的資源昆蟲，在復雜孽生環境中能夠將生物秸稈類有機廢棄物有效降解[19]，使其質地變松軟，為自身的生長發育提供能量和養分，原因在于家蠅體內具有能夠降解木質纖維素的一系列內源性木質纖維素酶。本研究以富含木質纖維素的高粱秸稈飼料飼養家蠅幼蟲，激活幼蟲體內木質素酶基因的高效表達。成功克隆家蠅木質素酶Lac-2生物信息學分析表明，其具有Cu-oxidase_3這個典型的高度保守離子結構域，位于168～245位氨基酸，且具有昆蟲漆酶特有的C-X-R-X-C結構，與其他昆蟲的Lac基因全長cDNA比較發現，家蠅Lac-2與親緣關系較近的物種廄螫蠅、柑橘小實蠅及地中海實蠅的同源性較高，在系統發育樹上的關系比較近，說明克隆的基因確為家蠅漆酶基因。通過生物信息學分析初步預測家蠅Lac-2基因編碼蛋白的特性，為該基因重組表達和酶功能深入研究奠定基礎。

目前，已有研究表明不同種類的昆蟲所含漆酶不同，其功能及組織表達也存在差異[20]，如黑尾葉蟬的NcLac-1僅表達于唾液腺，該酶在昆蟲體內主要參與植物次生酚類物質的降解[21]；煙粉虱MEAM1的Lac-1在取食能力較強的若蟲期及成蟲期表達量較高，在中腸中也遠高于其他組織，說明其在食物消化中有重要作用[13]；具備強木質纖維素降解能力的白蟻，其Lac-1較中腸及后腸高于唾液腺及前腸[22]；亞洲玉米螟的Lac-1于成蟲期表達量最高，主要在馬氏管、中腸、表皮及氣管中，推測其可能參與代謝或免疫；亞洲玉米螟的Lac-2在預蛹期表達量最高，主要存在于中腸、絲腺、氣管及表皮中，認為該酶參與昆蟲的蛻皮過程，參與表皮褐化。為進一步探明克隆家蠅Lac-2在體內的具體功能，以富含木質纖維素的純高粱飼養家蠅，在家蠅不同生長發育階段和3齡幼蟲不同組織中檢測Lac-2基因的表達差異表明，Lac-2基因在3齡幼蟲中表達量最高，由于家蠅是完全變態昆蟲，其蛻皮過程發生于1齡及2齡期，本研究發現Lac-2基因在3齡表達更高，推測其與家蠅蛻皮無關，但可能參與家蠅生長發育中化蛹活動的調控；同時，組織表達差異發現，該基因主要表達于消化道的中腸、唾液腺及后腸，推測家蠅Lac-2可能是在食物消化中發揮作用。后續將通過家蠅Lac-2基因原核重組蛋白功能和RNAi等方法進一步對該基因功能進行深入探究。

4 結論

成功克隆得到家蠅Lac-2基因，其cDNA序列全長為885 bp，編碼269個氨基酸，成熟肽編碼蛋白的理論分子量為25 kDa，等電點為7.19。Lac-2基因在家蠅3齡幼蟲中表達量最高，在中腸表達水平最高，其次是唾液腺及后腸。推測Lac-2基因可能參與家蠅生長發育與食物消化，為深入研究家蠅Lac-2的生物學功能奠定基礎。