花生油中黃曲霉毒素B1檢測能力驗證方法研究

◎ 蔡海華，梁培榮，姚澤平，林騰奕

（廣東省食品檢驗所（廣東省酒類檢測中心），廣東 廣州 510435）

黃曲霉毒素是人們生活中常見的食品污染物之一，結構上含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘臨酮，具有極強的致癌、致畸及肝毒性[1]，是已知的化學物質中最具致癌性的一種，極大地危害了人體健康。1993年黃曲霉毒素被世界衛生組織癌癥研究總署劃定為Ⅰ類致癌物，其化學性質穩定，高溫高壓也很難破壞，日常烹飪幾乎無損其毒性。黃曲霉毒素是花生油中最常見的污染物之一，其中尤以黃曲霉毒素B1（AFB1）污染最為普遍。花生油是我國大部分居民的主要食用油，因此花生油的質量安全與人們的身體健康息息相關。我國南方盛產花生，但是氣候潮濕溫暖，這為黃曲霉的產毒菌株營造了一個非常有利的生長和繁殖環境。在監督抽檢過程中發現，許多小作坊生產的花生油AFB1嚴重超標[2]。因此需要研究出一種準確快速簡便的AFB1含量檢測方法用于批量檢測樣品。

為提升本實驗室的檢測能力，2022年本實驗室參加了中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心實施的花生油中的黃曲霉毒素B1測定能力驗證計劃（ACASPT1499（2022））。以中檢院所發樣品為考核樣品，依據《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）中的第三法[3]，采用筆者優化過后的前處理方法對考核樣品進行檢測，通過加標的手段測定回收率來評價方法的合理性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

花生油（22-N213、22-O509），來自中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心；2.04 μg·mL-1黃曲霉毒素B1標準溶液（ROMER）。

1.1.2 試劑與耗材

甲醇（色譜級，默克化工技術（上海）有限公司）；黃曲霉毒素B1免疫親和柱（ROMER）。

1.1.3 儀器

電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；漩渦混合器（IKA）；冷凍離心機（Thermo）；高效液相色譜儀（日本島津公司）；C18色譜柱（Thermo）；光化學衍生器（華安麥科）。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取

將放至室溫的樣品搖勻，準確稱取1 g（精確至0.000 1 g）至離心管中，準確加入20 mL 70%甲醇水溶液，置于渦旋振蕩器中振蕩20 min，取出，在8 000 r·min-1下離心5 min，準確移取4 mL上清液，加入25 mL超純水，混勻。

1.2.2 樣品純化

使混勻樣液以3.0 mL·min-1的速度通過免疫親和柱，用10 mL水淋洗親和柱，并以真空泵抽干，后準確加入2 mL甲醇洗脫，收集洗脫液定容至2 mL。另一組樣品則按照《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）第三法，用2 mL甲醇淋洗免疫親和柱，收集洗脫液，50 ℃氮吹至干，用1 mL流動相復溶，樣液過0.2 μm濾膜，待測[4]。

1.2.3 加標樣品的處理

稱取樣品1 g（精確至0.000 1 g），準確加入0.050 mL 0.100 μg·mL-1的黃曲霉毒素 B1的標準溶液，后同樣品一起進行前處理操作，上機檢測計算回收率。

1.3 標準曲線繪制

將黃曲霉毒素B1標準溶液用甲醇配制成100 ng·mL-1標準儲備液，再用甲醇將其稀釋成0.1 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1的標準系列溶液。

1.4 液相色譜條件

流動相為甲醇水溶液（35+65），激發波長360 nm，發射波長440 nm。

2 結果與分析

2.1 標準工作曲線

標準品選擇合適的線性系列，使待測濃度盡可能分布于曲線的中間位置，根據預實驗結果，將曲線范圍選擇在0.1～20.0 ng·mL-1，線性方程為y=3 806.1x-310.03，R2=0.999 9，說明線性良好，見圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1標準工作曲線圖

2.2 能力驗證結果

由表1和表2可知，能力驗證樣品按照國家標準方法檢測得樣品22-N213和樣品22-O509的結果分別為 5.26 μg·kg-1和 8.26 μg·kg-1，與測試評價中心的指定值比較，Z比分數為-0.6和0.1；按照筆者優化后的方法檢測得出結果分別為 5.89 μg·kg-1和 8.15 μg·kg-1，與測試評價中心的指定值比較，Z比分數為0.4和0，結果均滿意。

表1 按照國標前處理進行實驗測得的結果表

表2 按照優化后的前處理方式進行實驗測得的結果表

3 實驗分析

3.1 優化實驗方法

根據《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.35—2016）第三法可知，其以甲醇乙腈水溶液為有機相。經方法驗證，用水和甲醇按65∶35的比例作為流動相，也可以較好地分離 AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG1。故從低毒性以及經濟效益方面考慮，筆者采用甲醇水溶液作為有機相。又因標準品稀釋溶劑的選擇應盡可能與流動相一致，以達到降低溶劑效應的目的，故在配制標準工作曲線過程中，將稀釋溶劑改成甲醇。在進行前處理優化后，黃曲霉毒素B1的檢測過程可以完全去除乙腈，避免實驗員接觸乙腈，降低了實驗過程的毒性風險。

在《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.35—2016）第三法中，純化過程使用2 mL甲醇淋洗免疫親和柱并收集洗脫液，在50 ℃下氮吹近干，后用1 mL流動相復溶。筆者將流動相改成甲醇水溶液后，純化步驟改為直接用2 mL甲醇進行洗脫，收集洗脫液并定容至2 mL。做此調整，可省去氮吹步驟，大大縮短了實驗時間，又因流動相換成甲醇水溶液，故用甲醇復溶也達到降低溶劑效應的目的，見圖2。

圖2 標準工作曲線上濃度點為2 μg·mL-1的色譜圖

3.2 實驗室參加能力驗證情況

關于本次實驗室參加能力驗證的完成情況見表1和表2，能力驗證以Z比分數評價該次實驗結果，Z比分數為負代表測定結果與中位值相比偏小，Z比分數為正則代表測定結果與中位值相比偏大，當|Z|≤2時，表示結果滿意[5]。由表1和表2可知，兩個樣品用兩種不同凈化方式得出的實驗結果|Z|均遠遠小于2，表明該次能力驗證實驗驗證了筆者優化的前處理方法，提高了實驗室檢測黃曲霉毒素B1的檢測效率。

3.3 實驗注意事項

黃曲霉毒素B1對紫外光敏感，因此在進行前處理的過程中，應盡量避光，配制工作曲線時應使用棕色玻璃器皿，避免環境因素影響實驗結果。此外，次氯酸、檸檬酸、高氯酸等強酸、強堿對黃曲霉毒素B1有明顯的破壞作用[4]，所以在檢測過程中應遠離上述試劑。黃曲霉毒素B1作為一種極強的致癌、致畸性毒素，在實驗過程中，實驗員切記要做好防護措施。在實驗完畢以后，所有實驗用過的器皿均應該使用5%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min以上，使黃曲霉毒素B1分解成無毒的鹽，避免造成二次污染。

4 結論

對《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.35—2016）第三法的前處理條件進行優化，選擇甲醇配制標準工作曲線，相關系數R2為0.999 9。選擇2 mL甲醇洗脫免疫親和柱，并收集洗脫液直接定容到2 mL，過0.2 μm濾膜上機待測，得到加標回收率為99.3%、105.2%。并將該優化方法應用到2022年花生油中黃曲霉毒素B1測定能力驗證，得出兩個樣品的測定結果值|Z|遠遠小于2。由此可得，該方法準確、簡便快捷，能夠明顯縮短檢測時間，可應用到植物油中黃曲霉毒素B1的批量檢測中。