高效液相色譜法測定飲料中10種合成著色劑和2種工業(yè)染料

◎ 梁培榮，蔡海華，張 敏，林騰奕

（廣東省食品檢驗(yàn)所（廣東省酒類檢測中心），廣東 廣州 510435）

食品的色澤一直是對食品質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)的一種重要指標(biāo)，而食品在生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲存等各環(huán)節(jié)中均會發(fā)生一定的化學(xué)或物理變化，導(dǎo)致食品的色澤發(fā)生一定程度的改變，因此廠家常使用色素來保持食品色澤。添加食用著色劑可維持食品的原色澤，其根據(jù)來源分為天然和合成著色劑。合成著色劑顏色更鮮艷、著色能力更強(qiáng)、著色更穩(wěn)定持久且價(jià)格便宜，但其多以芳烴類化工品為原材料化合形成，作為一種化工產(chǎn)品，若長期食用對人體健康具有潛在危害[1-3]。

為了對合成著色劑進(jìn)行監(jiān)管，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中對食品合成著色劑的使用作出了規(guī)定，其中包括本次監(jiān)測的檸檬黃、日落黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、酸性紅、赤蘚紅、亮藍(lán)和靛藍(lán)等。而酸性橙Ⅱ、酸性大紅GR等工業(yè)染料具有高毒性，若與人體接觸或被食用會具有“三致”等危害［4-6］。《關(guān)于印發(fā)全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治抽檢工作指導(dǎo)原則和方案的通知》（食品整治辦〔2009〕29號）將酸性橙等工業(yè)染料列為禁用的添加劑。

目前，常見的色素檢測方法有高效液相色譜法[7-10]、毛細(xì)管電泳法、示波極譜法等[11-12]，其中高效液相色譜法因儀器靈敏度高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛使用。目前，對于食品中禁用工業(yè)染料的測定方法的研究較多，多使用高效液相色譜法［13-14］。GB 5009.35—2016、GB/T 21916—2008和SN/T 1743—2006等標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了部分著色劑的檢測方法[15-17]。這些標(biāo)準(zhǔn)大多只檢測一種或幾種色素，前處理較為復(fù)雜，回收率不高，無法同時(shí)對多種著色劑和工業(yè)染料進(jìn)行檢測。因此，建立一種能同時(shí)測定工業(yè)染料和著色劑的高效液相色譜檢測方法具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市場銷售的某品牌飲料；檸檬黃、日落黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、酸性紅、赤蘚紅、亮藍(lán)和靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品（壇墨）；酸性Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品（阿爾塔）；酸性大紅GR標(biāo)準(zhǔn)品（bepure）；甲醇（HPLC，美國Fisher公司）；乙酸銨（HPLC，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為一級水。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY Arc高效液相色譜儀（配PDA檢測器，美國Waters公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；超聲波清洗器（昆山KQ-500DE型號數(shù)控）；高速冷凍離心機(jī)（Thermo Heraeus Multifuge X1R）；漩渦振蕩器[艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量固體標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中用10%甲醇水溶解并定容至刻度，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。其中，檸檬黃、日落黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、酸性紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)和酸性大紅GR配制成濃度為1.00 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液；酸性橙Ⅱ配制成濃度為100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

臨用時(shí)用10%甲醇水逐級稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。其中酸性橙Ⅱ濃度分別為 0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.20 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1和5.00 mg·L-1；其余組分濃度均為 0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1和50.0 mg·L-1。

1.3.2 樣品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取5 g試樣（樣品含二氧化碳則先水浴加熱除去二氧化碳）于50 mL帶蓋離心管中，加10%甲醇水15 mL渦旋混勻，超聲20 min，以8 500 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻。取適量上清液過0.45 μm濾膜，待高效液相色譜測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ChromCore C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A甲醇，流動相B乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）；流速：1.00 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測器：PDA檢測器；檢測波長：254 nm。流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序表

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇

10種合成著色劑均為水溶性，酸性橙Ⅱ和酸性大紅GR均易溶于水。樣品通過10%的甲醇水溶液超聲20 min后提取，再經(jīng)離心后轉(zhuǎn)移定容取上清液，經(jīng)微孔濾膜過濾后進(jìn)樣，此操作前處理簡單且回收率好。

2.2 流動相的選擇

參考 GB 5009.35—2016方法，采用 20 mmol·L-1乙酸銨和甲醇的混合流動相體系，通過對洗脫條件的梯度優(yōu)化，使12種組分獲得較好的分離。優(yōu)化后的梯度洗脫條件見表1。

2.3 色譜柱的選擇

目前，關(guān)于食品添加劑的檢測主要采用C18色譜柱[18-19]。本實(shí)驗(yàn)考察了不同品牌的C18色譜柱對目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明，在ChromCore C18色譜柱上各組分的色譜峰峰形尖銳對稱，柱效高的同時(shí)分離度好，能在14 min內(nèi)完成所有目標(biāo)物的分離，滿足快速檢測需求。因此，選擇ChromCore C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行檢測。

2.4 柱溫的選擇

考察了柱溫為30 ℃、35 ℃和40 ℃時(shí)對各組分的分離效果。在相同流動相和色譜柱條件下，隨著柱溫的變化，各組分的保留時(shí)間變化不大。但當(dāng)柱溫為30 ℃和40 ℃時(shí)，酸性紅和亮藍(lán)分離度較小。而柱溫為35 ℃時(shí)各組分分離度好且峰形尖銳對稱，故選擇柱溫為35 ℃。

2.5 空白溶劑對測定結(jié)果的影響

在相同的提取條件和液相條件下測定，12種組分10%甲醇試劑空白的色譜圖和混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1。由圖1可知，空白提取溶劑對各組分的含量測定未產(chǎn)生影響。

圖1 10%甲醇溶液、12組分混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.6 方法的線性范圍與檢出限

取配制好的12組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化后的條件進(jìn)行分析，以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得到各組分的線性回歸方程。檢出限按3倍信噪比計(jì)算，結(jié)果見表2。由表2可知，各組分線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.20 ～ 1.00 mg·kg-1。

表2 12種組分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限表

2.7 方法的加標(biāo)回收率和精密度

稱取飲料空白基質(zhì)樣品，按照3個水平進(jìn)行加標(biāo)，平行測定8次，另外做2個空白平行，作空白扣除后，計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。各組分平均回收率為90.73%～98.84%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。本方法的加標(biāo)回收率和精密度均滿足實(shí)際檢測的要求。

表3 12種組分的回收率和精密度表（n=8）

3 結(jié)論

本方法建立了同時(shí)測定飲料中的10種合成著色劑和2種工業(yè)染料的高效液相色譜法，經(jīng)驗(yàn)證本方法前處理簡單、實(shí)驗(yàn)時(shí)間短、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性好，適合于日常食品中液體樣品中多種著色劑的測定，同時(shí)對國家標(biāo)準(zhǔn)中沒有同時(shí)檢測工業(yè)染料和著色劑的方法進(jìn)行補(bǔ)充，為食品安全檢測提供一定的參考。