淡竹葉多肽的提取及抑菌性研究

◎ 李 琴，王 倩，潘麗燕，蔣 行，鮑會梅

（江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇 淮安 223003）

淡竹葉（Lophatherum gracileBrongn.）是禾本科，屬多年生草本植物，富含多酚、黃酮、多糖、三萜類等生物活性物質[1]。《本草綱目》記載了淡竹葉這種草藥具有多種藥理活性，包括利尿作用及舒緩心臟壓力、口腔潰瘍和煩躁不安[2]。除作藥用外，淡竹葉還可應用于食品、保健品等領域[3]。

目前的果蔬防腐保鮮方法通常是物理法和化學法，但都有一定的缺點。例如，物理法使用冷藏，成本高，而化學法使用化學殺菌劑存在一定的潛在毒性[4]。植物源抑菌劑通常是來源于天然植物中的一些生物活性物質，相比較于人工合成的抑菌劑，植物源抑菌劑安全性高、毒副作用小且綠色環保，具有較高的開發潛力和廣闊的應用前景[5]。

當前，對于藥食同源的原料淡竹葉的研究集中于其藥理作用和其中活性物質如黃酮的提取與活性研究[6-7]，而對淡竹葉中多肽的研究鮮有報道。本研究對淡竹葉多肽進行提取并測其抑菌活性，為淡竹葉多肽作為天然抑菌劑的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡竹葉：八仙村野生草藥坊店鋪購買；堿性蛋白酶：夏盛（北京）生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、牛血清蛋白、葡萄糖、三氯乙酸、蛋白胨和牛肉膏：國藥集團化學試劑有限公司；酵母菌、青霉菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌：南京漢欣微生物實驗室。

1.2 儀器與設備

101-3BS粉碎機：永康市圣象電器有限公司；FE20 pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；KH5200B超聲波清洗儀：昆山禾創超聲儀器有限公司；TDL-5M離心機：湘儀離心機儀器有限公司；UV-2700紫外分光光度計：島津公司；HH-4水浴鍋：常州國華電器有限公司；LMQC-100E高壓滅菌鍋：山東新華醫療器械有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺：蘇凈安泰空氣技術有限公司。

1.3 淡竹葉多肽的提取及工藝優化試驗

1.3.1 淡竹葉預處理

將淡竹葉于45 ℃烘箱中干燥1～2 d，用粉碎機充分打磨成粉末后，過60目篩。利用環己烷進行脫脂，干燥密封保存。

1.3.2 淡竹葉蛋白的制備

稱取一定量的淡竹葉粉置于燒杯中，加入水，調節料液比為1∶15，pH為9.5。60 ℃水浴超聲（400 W）提取2 h。提取結束后，在轉速4 800 r·min-1下離心20 min取上清。然后調節上清pH為5.0，4 800 r·min-1離心20 min，收集沉淀，用去離子水洗滌3次，冷凍干燥得淡竹葉總蛋白。

1.3.3 淡竹葉多肽的制備

淡竹葉多肽的制備流程為淡竹葉→預處理→制備淡竹葉蛋白→酶解淡竹葉蛋白→滅酶（沸水浴15 min）→冷卻→離心（4 500 r·min-1，20 min）→旋轉蒸發→冷凍干燥。

1.3.4 淡竹葉多肽含量及得率的測定

采用比色法[8]測定多肽含量，配制0 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1和 1.4 mg·mL-1的 Gly-Gly-Tyr-Arg 四 肽標準溶液。分別取標準溶液2 mL，雙縮脲試劑8 mL，振蕩混勻，靜置45 min后，取上清液于540 nm下測定吸光度值。樣品測定時，往樣品溶液中加入等體積10%的三氯乙酸溶液，混勻靜置30 min后，離心15 min（4 000 r·min-1），取上清液2 mL，按標準溶液測定方法操作得到吸光度值。以多肽含量為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線為y=0.063 8x+0.002 8，R2=0.996 3。多肽得率計算公式為

式中：V為樣品溶液體積，mL；C為樣品溶液多肽的濃度，mg·mL-1；m為原料中蛋白質的含量，mg。

1.3.5 酶解淡竹葉蛋白試驗設計

選取堿性蛋白酶，料液比為1∶15，設計單因素試驗探究酶解溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃）、酶解時間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h）、酶 解 pH（7.5、8.5、9.5、10.5和 11.5）、 加 酶 量（3 000 U·g-1、4 000 U·g-1、5 000 U·g-1、6 000 U·g-1和7 000 U·g-1）對酶解效果的影響，確定酶解制備淡竹葉多肽的最佳條件。

利用Design-Expert 8.0.6軟件，設計4因素3水平的響應面分析試驗。響應面試驗因素與水平設計如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平表

1.4 抑菌活性檢測

1.4.1 菌種的活化培養

參考曹陽等[9]的方法，將青霉菌、酵母菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌分別放置于相應的培養基中培養。無菌條件下，分別挑取5環菌株置于對應的液體培養基中，分別在28 ℃和37 ℃下培養24 h和48 h備用。

1.4.2 淡竹葉片多肽液抑菌效果的測定

采用濾紙片法[10]對淡竹葉多肽的抑菌性進行測定，并稍作修改。將打孔滅菌處理過的濾紙片分別置于0%、20%、40%、60%、80%和100%的淡竹葉多肽提取液中，浸泡5 h。將菌懸液接種到各個固體培養基上。取出浸泡的濾紙，放入各介質中，用十字交叉法測定抑菌圈直徑。抑菌性指標由抑菌圈直徑來衡量。

2 結果與分析

2.1 淡竹葉多肽制備工藝優化

2.1.1 單因素試驗結果

圖1顯示了酶解各因素對淡竹葉多肽得率的影響。圖1a表明，隨著酶解溫度的升高，多肽得率呈現先升高后降低趨勢。當酶解溫度在30～50 ℃時，酶活性能被最大限度地激活，酶解反應加快，多肽得率也大大提高。酶解溫度為50 ℃時，多肽得率達到最大。但當酶解溫度過高時，酶的活性會降低，因此確定最佳酶解溫度為50 ℃。圖1b表明，多肽得率隨酶解時間的延長而呈現先升后降的趨勢，酶解2 h時多肽得率達到（7.78±0.25）%。再繼續酶解，多肽得率并未增加，推測原因是溶液中底物濃度達到飽和[11]，因此確定酶解最適時間為2.0 h。pH的改變會影響酶活力部位的帶電情況，從而影響酶與底物的結合。由圖1c可知，淡竹葉蛋白在堿性環境下酶解效果較好，最適的pH為9.5[12]。由圖1d可知，隨著加酶量的增加，多肽得率先增加后減少，當加酶量為5 000 U·g-1時，多肽得率最高，可達（7.85±0.21）%。這是因為在底物充足的條件下，酶反應的速率與酶濃度成正相關，而當酶濃度過高時，酶分子之間可能發生相互水解，導致酶活力下降[13]。

圖1 酶解各因素對多肽得率的影響圖

2.1.2 響應面試驗設計及結果

響應面試驗設計及結果見表2。多元回歸方程的方差分析結果見表3。對數據進行方差分析，得到方差的顯著性檢測和回歸方程為多肽得率=7.86+0.19A+0.26B+0.48C+0.45D+0.087AB-0.085AC-0.140AD+0.050BC+0.060BD+0.11CD-0.80A2-1.12B2-0.87C2-0.47D2。由表3可知模型顯著，說明模型擬合度高，可用來對本試驗結果進行優化。各因素的顯著性顯示，酶解溫度、酶解時間pH和加酶量對酶解提取多肽的工藝有極顯著的影響（P＜0.01）。

表2 響應面試驗設計及結果表

表3 多元回歸方程的方差分析表

2.1.3 響應面分析

響應曲面開口朝下，說明響應值存在極大值點。等高線圖可反映兩因素間交互作用的強弱。等高線形狀為橢圓形和圓形分別表示兩因素之間交互作用顯著和不顯著[14-15]。

由圖2～圖4可知，淡竹葉多肽得率隨著酶解溫度、時間、pH的增加呈現先升高后降低的趨勢，存在極大值。圖2～圖4中AB、AC、BC等高線似圓形，表明彼此間相互作用較弱，與表3中得到的方差分析結果一致。

圖2 酶解溫度和酶解時間對淡竹葉多肽得率影響圖

圖3 酶解溫度和pH對淡竹葉多肽得率影響圖

圖4 酶解時間和pH對淡竹葉多肽得率影響圖

2.1.4 最佳提取工藝驗證

根據響應面模型，獲得的淡竹葉多肽的最佳提取工藝模型為酶解溫度50.06 ℃、酶解時間2.14 h、pH值9.81、加酶量5 525 U·g-1。通過最佳提取工藝，淡竹多肽得率達到8.07%。為驗證回歸模型的可靠性，將條件修正為酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h、pH值9.8、加酶量5 525 U·g-1進行3次平行驗證試驗，結果為（7.95±0.15）%。試驗結果接近預測值，說明此響應面優化工藝用于提取淡竹葉多肽是可行的，回歸模型和實際值契合性較好。

2.2 抑菌活性試驗結果

由表4可知，淡竹葉酶解產物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有較好的抑菌效果，對酵母菌和青霉菌抑菌效果不明顯。隨著淡竹葉多肽液的體積分數增大，對5種菌的抑制作用也在不斷增強。前人在研究淡竹葉提取物抑菌防腐作用時，發現其對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、綠膿桿菌和大腸桿菌都具有一定的抑菌效果，且對金黃色球菌抑制效果最強，而對青霉抑菌效果不明顯[16]。江惠[17]在研究竹葉天然多肽的抑菌效果時發現，竹葉多肽對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均具有良好的抑菌作用，且對前兩種菌種的抑制作用最強，本文研究結果與其相似。

表4 抑菌活性試驗結果表

3 結論

以淡竹葉為原料，通過堿性蛋白酶酶解法制備得到淡竹葉多肽。響應面法優化得到最佳提取工藝為酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h、pH為9.8、加酶量5 525 U·g-1，在此條件下，淡竹葉多肽的得率達到了（7.95±0.15）%。抑菌試驗結果表明，淡竹葉多肽液對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌具有較強的抑制作用，而對酵母菌和青霉菌抑制效果不明顯。淡竹葉多肽可作為天然的抑菌劑添加到果蔬中，達到抑菌防腐的效果。