miR-30a-5p 表達對結直腸癌發生及轉移的影響研究

彭柳花，賈雄，賀德，陳天明

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床消化道常見惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、早期轉移侵襲能力較強和患者預后5 年生存率較低等特點。既往研究數據顯示［1］，我國CRC 發病率約15%，死亡率約10%。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是CRC 腫瘤細胞發生侵襲、轉移的始動因素，是導致CRC 患者病情進展的重要因素［2］。微小RNA（microRNA，miR）被證實在腫瘤的惡性進展中發揮廣泛生物學功能［3-4］。miR-30a-5p在肺癌、腦膠質瘤、腎細胞癌等惡性腫瘤中表達降低。而miR-30a-5p 表達的異常是否與CRC 的病情進展有關，尤其是miR-30a-5p 是否能通過調控CRC患者EMT 過程從而促進病情進展仍需進一步研究［5］。基于此背景，本研究擬通過離體實驗和在體實驗，以期明確miR-30a-5p 表達與CRC 病情發展的關系及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和細胞系 采用NCM460、HCT116 細胞系和裸鼠作為研究對象。本研究經南方科技大學醫院倫理委員會批準。

1.1.2 試劑與儀器 倒置熒光顯微鏡（深圳市眾尋光學儀器有限公司），細胞培養箱（濟南好來寶醫療器材有限公司），Chemi Doe XRS+成像儀（上海土森視覺科技有限公司），渦旋振蕩器（河北慧采科技有限公司），流式細胞儀（南京珺蔚生物科技有限公司），SP 試劑盒（上海研啟生物科技有限公司），H202（夏津尚達經貿有限公司），檸檬酸鹽緩沖溶液（武漢卡諾斯科技有限公司），DAB 溶液（廣州鼎國生物技術有限公司），蘇木精碧（上海如吉生物科技發展有限公司），Trizol（北京華越洋生物科技有限公司），逆轉錄試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），RIPA 裂解液（上海邦景實業有限公司），胎牛血清（上海滬震實業），高糖培養基（廣州濟恒醫藥科技），雙抗（北京博奧派克生物科技），Lipofectamine 2000（上海北諾生物科技有限公司），MTT細胞增殖（北京百奧創新科技有限公司），細胞毒性檢測試劑盒（上海歌凡生物科技有限公司），Transwell 小室（南京迅貝生物科技有限公司），培養基（山東萍聚生物科技有限公司），雙抗霉素（湖北貓爾沃生物醫藥有限公司），胰酶（鄭州裕和食品添加劑有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 選取NCM460、HCT116 細胞系作為研究對象。將細胞置于常規培養基（DEME 培養基、1640 培養基）中進行培養，并在培養基中補充10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 mg/L 鏈霉素。當細胞融合度＞80%時進行消化、傳代操作，并取對數期細胞進行后續實驗。

1.2.2 qRT-PCR 檢測 采用Trizol 法提取上述培養完成細胞的總RNA，逆轉錄得到cDNA，隨后嚴格按照試劑盒說明進行操作。反應條件：90 ℃預變性6 min；95 ℃變性15 s，64 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，重復42 個 循 環。引 入 序 列：（forward）CTCTACAGCTATATTGCCAGCCAC；（reverse） CTCTACAGCTATATTGCCAGCCAC。

1.2.3 細胞轉染 取對數期的HCT116 細胞，每組3 個平行樣本，接種至6 孔板（1×105個/ml），并進行培養。實驗分組為對照組、miR-30a-5p 模擬物組和miR-30a-5p 抑制劑組。嚴格按照LipofactamineTM2000 試劑盒說明書轉染miR-30a-5p 模擬物、miR-30a-5p 抑制劑，對照組不做任何處理。轉染操作完成后繼續進行培養，48 h 后進行后續實驗。

1.2.4 miR-30a-5p mRNA 表達水平檢測 采用同

1.2.2 中的方法及引物設計，檢測NCM460、HCT116細胞系中miR-30a-5p mRNA 表達水平。

1.2.5 HCT116 細胞Transwell 實驗觀察侵襲能力 取Transwell 杯狀小室，首先將Matrigel 膠進行稀釋，稀釋操作完畢均勻涂抹至杯底，于下室滴入含10%胎牛血清的培養基，于上室中滴入各組10%細胞懸液200 μl。培養24 h 直至Matrigel 膠降解。培養完成后將小室取出并進行沖洗（PBS）和染色，染色操作完畢采用無菌棉簽將上層細胞擦去，進行細胞計數觀察。

1.2.6 HCT116 細胞劃痕試驗觀察遷移能力 取上述實驗中培育至48 h 的細胞。重懸后接種至6 孔板，待細胞融合后將培養基棄去，并采用20 μl 移液器槍頭在培養板底部進行劃痕操作，并重新加入培養基后再次培養過夜，次日顯微鏡拍照后計算細胞遷徙率。

1.2.7 Western blotting 法檢測HCT116 細胞Ecadherin、Vimentin 表達量 取上述實驗中培育至48 h 的HCT116 細胞，提取全蛋白并進行定量，定量操作嚴格按照試劑盒說明進行。取適量樣本進行凝膠電泳，操作完成后進行洗滌，滴入E-cadherin、Vimentin 的一抗（1∶1 500），4 ℃條件下孵育過夜，次日滴入二抗（1∶2 000），再次在室溫下孵育2 h，孵育完成后再次進行洗滌。洗滌操作完成后加入發光液，并進行顯影、成像等操作。所有實驗操作均進行3 次，取平均值。

1.2.8 裸鼠成瘤實驗 按miR-30a-5p 模擬物、miR-30a-5p 抑制劑、對照組的分組方式進行裸鼠成瘤實驗，每組8 只。在實驗前所有裸鼠均于同樣條件下進行飼養，時間1 周。將轉染完成細胞采用1 000 r/min進行離心（離心半徑16 cm），時間為5 min，隨后采用PBS 進行沖洗，沖洗完畢收集細胞。采用皮下注射的方式將1×106個轉染完成的HCT116 細胞注射至裸鼠腹腔內。隨后每日觀察裸鼠腫瘤的大小，計算生長40 d 后的腫瘤體積。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0 軟件進行數據統計。正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NCM460、HCT116 細胞系miR-30a-5p mRNA表達水平比較

在HCT116 細胞中miR-30a-5p mRNA 表達量（0.29 ± 0.02）較在NCM466 細胞中表達量（0.76 ±0.12）明顯更低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組侵襲能力比較

與對照組比較，miR-30a-5p 模擬物組細胞侵襲能力明顯更弱，而miR-30a-5p 抑制劑組細胞侵襲能力明顯更強，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組侵襲能力比較（± s，每組n=3）

表1 各組侵襲能力比較（± s，每組n=3）

注：與對照組比較aP＜0.05

組別miR-30a-5p 模擬物組miR-30a-5p 抑制劑組對照組F 值P 值每個視野進入細胞數量62.57±6.32a 187.67±17.65a 130.57±12.67 21.37＜0.05

2.3 各組遷移能力比較

與對照組比較，miR-30a-5p 模擬物組細胞遷移能力明顯更弱，而miR-144-3p 抑制劑組細胞遷移能力明顯更強，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組遷移能力比較（± s，每組n=3）

表2 各組遷移能力比較（± s，每組n=3）

注：與對照組比較aP＜0.05

組別miR-30a-5p 模擬物組miR-30a-5p 抑制劑組對照組F 值P 值每個外溢穿膜細胞數量45.23±6.70a 93.23±6.70a 75.21±8.33 15.62＜0.05

2.4 各組E-cadherin、Vimentin 蛋白表達水平比較

與對照組比較，miR-30a-5p 模擬物組Vimentin明顯更低，E-cadherin 明顯更高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；miR-30a-5p 抑制劑組Vimentin 明顯更高，E-cadherin 明顯更低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組E-cadherin、Vimentin 蛋白表達水平比較（± s，每組n=3）

表3 各組E-cadherin、Vimentin 蛋白表達水平比較（± s，每組n=3）

注：與對照組比較aP＜0.05

組別miR-30a-5p 模擬物組miR-30a-5p 抑制劑組對照組F 值P 值E-cadherin 1.78±0.67a 0.42±0.17a 1.08±0.08 6.17＜0.05 Vimentin 0.54±0.03a 2.03±0.67a 1.06±0.12 5.85＜0.05

2.5 40 d 時裸鼠腫瘤體積比較

與對照組比較，miR-30a-5p 模擬物組腫瘤體積明顯更小，miR-30a-5p 抑制劑組腫瘤體積明顯更大，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 40 d 時裸鼠瘤體體積比較（mm3，± s）

表4 40 d 時裸鼠瘤體體積比較（mm3，± s）

注：與對照組比較aP＜0.05

組別miR-30a-5p 模擬物組miR-30a-5p 抑制劑組對照組F 值P 值腫瘤體積637.57±61.57a 1 489.54±123.54a 987.67±68.78 11.21＜0.05例數8 8 8

3 討論

CRC 是起源于上皮組織的消化道惡性腫瘤，糖尿病史、家族史、高血壓史、高脂飲食和低纖維飲食是導致CRC 發生的危險因素［6］。近年來，隨著微創切除術治療方法的逐年規范化和術后聯合放化療綜合療法的推行，CRC 患者預后5 年生存率得到顯著提升［7］。然而CRC 具有易侵襲、轉移的特征，而起病初期又較隱匿，使得部分患者就診時已錯過手術治療最佳時期。遠處轉移是影響CRC 患者預后生存期的獨立危險因素，既往研究數據顯示［8-10］，15%～25% 患者存在肝轉移。故進一步探討CRC患者轉移的分子病理特征，在早期進行篩查并針對高風險人群進行靶向干預的意義重大。

miR-30a-5p 是miR-30 家族成員，其定位于人類6 號染色體的q13 位置。國內外大量研究發現，在前列腺癌、喉鱗狀細胞癌等惡性腫瘤中miR-30a-5p 的表達下調［11-12］。邱會等［13］研究發現，miR-30a-5p 的表達對非小細胞肺癌（NSCLC）細胞的增殖及遷移存在靶向調控作用。何雨等［14］研究發現，miR-30a-5p 可通過調節胰腺導管腺癌患者成纖維細胞活化，從而影響腫瘤的增殖、遷移過程。王勇等［11］研究發現，前列腺癌患者miR-30a-5p 的表達改變與腫瘤細胞的增殖、侵襲行為密切相關。此外有研究發現，miR-30a-5p 可通過影響腫瘤細胞的EMT 過程，從而影響腫瘤細胞的侵襲和遷移［15-16］。EMT 主要指細胞外基質與腫瘤基底膜被破壞、細胞間喪失黏附和細胞極性變化，使腫瘤細胞遷移和侵襲能力被顯著增強［17］。E-cadherin 的表達降低和Vimentin的表達顯著上升是反應EMT 過程的重要參考［18］。本研究結果顯示，HCT116 細胞中miR-30a-5p 的表達明顯更低，提示miR-30a-5p 的表達改變可能與CRC 患者基礎病理發展有關。為進一步驗證miR-30a-5p 在CRC 中發揮的作用，本研究通過轉染miR-30a-5p 模擬物和miR-30a-5p 抑制劑，結果顯示，miR-30a-5p 模擬物組HCT116 的侵襲和遷移能力明顯低于miR-30a-5p 抑制劑組，表明miR-30a-5p的表達改變與CRC 侵襲、遷移行為有關。為進一步明確miR-30a-5p 的作用機制，采用Western bloting法檢測Vimentin 和E-cadherin 的表達水平，結果顯示，較miR-30a-5p 抑制劑組，miR-30a-5p 模擬物組Vimentin 明顯更低，而E-cadherin 明顯更高，表明miR-30a-5p 可通過調控CRC 細胞的EMT 行為影響病情進展。本研究采用裸鼠進行在體實驗發現，細胞注射完成40 d 后，miR-30a-5p 抑制劑組腫瘤體積顯著高于miR-30a-5p 模擬物組，證實miR-30a-5p的表達改變與CRC 的發生密切相關，亦明確臨床可通過監測結直腸癌患者miR-30a-5p 的表達情況，對其病情發展作出預測并為臨床的早期靶向干預提供新線索［19］。

綜上所述，miR-30a-5p 可通過調控CRC 患者EMT 過程，從而影響腫瘤病情的發生、發展。然而本研究尚存不足，未納入臨床CRC 前瞻性隊列作為研究對象，故在今后研究中仍需進一步開展實驗予以論證。