基于新國標的兩種微生物法測定乳粉中葉酸的比對研究

嚴家俊，姚麗鋒，綦 艷，張 娟，黃翠莉，吳思敏

1 廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東佛山 528300 2 拱北海關技術中心，廣東珠海 519015

0 引言

葉酸是一種由對氨基苯甲酸、蝶呤和谷氨酸組成的B族維生素[1]。為維持人體正常生理功能所必需。然而，人體自身無法合成葉酸，需通過外部攝取補充。缺乏葉酸會導致人類疾病，如神經管畸形、先天性心臟病、兒童哮喘等[2，3]。但是過量攝入葉酸也會引起一些并發癥，如干擾抗驚厥藥物發揮作用和機體對鋅的吸收、掩蓋VB12缺乏的初期表現、神經發育毒性等[4，5]。

乳粉作為嬰幼兒早期營養攝入的主要來源，對其質量控制及其重要。我國即將施行的標準《GB 10765—2021食品安全國家標準嬰兒配方食品》《GB 10766—2021食品安全國家標準較大嬰兒配方食品》《GB 10767—2021 食品安全國家標準幼兒配方食品》均對葉酸的添加量進行了更嚴格的規定，嬰兒食品中葉酸限量由2.5～12 μg/kJ更新為2.9～12 μg/kJ，幼兒食品中葉酸限量由不小于1 μg/kJ更新為2.4～12 μg/kJ。因此，對嬰幼兒乳粉中葉酸含量的檢測具有重大的意義。

目前葉酸的測定方法主要有化學發光法[6]、紫外吸收光譜法[7]、熒光分析法[8]、高效液相色譜法[9]、酶聯免疫法（ELISA）[10]、伏安法[11]和微生物法[12，13]等。其中微生物法是經典的葉酸測定方法，能反映樣品中總葉酸含量[14]。作為食品中葉酸含量檢測的國標指定方法，《GB 5009.211—2022 食品安全國家標準食品中葉酸的測定》已于2022年6月發布更新，并將于2022年12月實施，新標準依舊將微生物法作為食品中葉酸測定的唯一方法。與2014版的標準相比，新標準增加了微孔板測定方法。本研究通過對即將實施的標準GB 5009.211—2022中試管法和微孔板法檢測乳粉中葉酸進行比較，根據數據的差異與試驗情況比對兩種方法的優缺點，為乳粉中葉酸含量測定以及新標準的實施提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

葉酸標準品（純度≥97%）；氫氧化鈉乙醇溶液（0.01 moL/L）；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus Caseispp. RhamnosusATCC 7469）；菌種儲備用瓊脂培養基；葉酸測定用培養基。

1.2 儀器與設備

XGI.D型真空滅菌器，山東新華醫療器械股份有限公司；ZQZY-CS8V振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機，德國艾本德股份公司；ML204萬分之一電子天平，梅特勒-托利多國際有限公司；UV-1900分光光度計，島津企業管理（中國）有限公司；Vortex-Genie 2渦旋混合器，美國Scientific Industries。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準工作液的制備

準確稱取一定量的葉酸標準品，用氫氧化鈉乙醇溶液逐步稀釋至0.200 ng/mL，制成標準工作液。

1.3.2 接種液的制備

將鼠李糖乳桿菌連續轉種3 代后，接種至菌種儲備用瓊脂培養基中，36 ℃培養24 h。取2 mL葉酸標準工作液與4 mL葉酸測定用培養基混勻，分裝至2 支試管中，高壓滅菌制成種子培養液。將活化后的菌株轉接與種子培養液中，36 ℃培養24 h后，吸取0.5 mL至無菌葉酸測定用培養基中，36 ℃培養6 h，制成接種液。

1.3.3 樣液的制備

準確稱取1.000 g樣品，精確至0.001 g，加入80.000 mL氫氧化鈉乙醇溶液，超聲振蕩2～4 h后，轉入100.000 mL容量瓶中，用水定容，搖勻。再用水進行適當的稀釋。

1.3.4 試管法

（1）試樣系列管

取試管，分別加入1.000 mL、2.000 mL、3.000 mL試樣稀釋液，補水至5.000 mL。每梯度做2 個平行。

（2）標準系列管

取試管分別加入葉酸標準工作液，補水至5.000 mL，使標準系列管中葉酸含量分別為0.000 ng、0.050 ng、0.100 ng、0.200 ng、0.300 ng、0.400 ng、0.500 ng、0.600 ng、0.800 ng、1.000 ng。每個標準點做3 個平行。

（3）滅菌、接種與培養

將測定系列管、葉酸測定培養基于121 ℃滅菌5 min，冷卻至室溫后，加入一定量的接種液至葉酸培養基中，使其接種液濃度為4‰，5.000 mL每管分裝于每支測定管中，另取一支標準0管加入葉酸測定培養基作為0對照管。混勻后，置于36 ℃培養20～40 h，直至獲最大濁度。

（4）測定

使用混勻振蕩器將培養好的試管混勻，于540 nm處，以0對照管調節吸光度值為0，依次測定各試管培養液。

1.3.5 微孔板法

（1）試樣系列管

使用0.22 μm無菌水相濾膜過濾除菌試樣稀釋液，取1.500 mL離心管，分別加入100 μL、200 μL、300 μL試樣稀釋液，補水至500 μL。每梯度做2 個平行。

（2）標準系列管

按1.3.4（2）中制備方式，體積按比例縮減至1.0 mL。無菌條件下，使用0.22 μm無菌水相濾膜過濾除菌至1.500 mL離心管中。每個標準點做3 個平行。

（3）滅菌、接種與培養

葉酸測定培養基于121 ℃滅菌5 min，冷卻至室溫后，加入一定量的接種液至葉酸培養基中，使其接種液濃度為4‰，吸取150 μL加入微孔板中。另吸取150 μL標準系列管或試樣系列管加入微孔板中，覆膜，混勻，置于36 ℃培養32～40 h。

（4）測定

混勻微孔板中培養物，于540 nm處測定吸光度值。

1.3.6 計算

以標準系列管中葉酸的含量為橫坐標，各個標準點吸光度值的平均值為縱坐標，繪制標準曲線。通過標準曲線換算試樣系列管中葉酸的相應含量，以此計算樣品中葉酸的含量。

2 結果與分析

2.1 準確度試驗

以SRM 1869乳基標準物質做為樣品，分別使用兩種方法獨立重復測定6 次，計算結果的與真值的符合程度和相對標準偏差（Relative tandard Deviation，RSD），以此衡量兩種方法的準確度。結果如表1所示。

表1 試管法與微孔板法測定SRM 1869 中葉酸含量的比較

由SRM 1869說明書可知，該樣品中葉酸含量為（223.9±8.6）μg/100g，2 種方法所測結果都與標示值相符，滿足要求，方法的準確性良好。兩種方法的RSD分別為2.7%和2.9%，無明顯差異。

2.2 重復性試驗

隨機選取5 種不同的乳粉作為試驗樣品，使用兩種方法分別對每個樣品進行6 次重復性試驗，觀察測量結果之間的一致性，結果如表2、表3所示。

表2 試管法的重復性試驗結果

從表2結果可知，利用試管法檢測的5 種不同品牌的乳粉中葉酸含量，每個樣品的6 個測定結果較接近，RSD值為1.3%～3.1%，說明方法重復性較好；從表3結果可知，利用微孔板法檢測的5 種不同品牌的乳粉中葉酸含量，每個樣品的6 個測定結果較接近，RSD值為1.6%～2.9%，說明方法重復性同樣較好。

表 3 微孔板法的重復性試驗結果

3 結論與討論

從試驗結果比較可知，兩種方法檢測結果都與乳基標準物質1869證書中葉酸標示值相符，方法的準確性良好，且無明顯差異。重復性試驗結果可知，利用GB 5009.211—2022試管法檢測葉酸含量，試驗結果之間一致性較好，RSD值為1.3%～3.1%。利用GB 5009.211—2022微孔板法檢測葉酸含量，試驗結果之間一致性同樣較好，RSD值為1.6%～2.9%。兩種方法均能有效檢測乳粉中葉酸含量。

比較兩種方法的差異。在制備方面，試管法的樣液和標液使用高壓滅菌鍋滅菌。微孔板法使用無菌水相濾膜對樣液和標液進行過濾除菌。考慮到在進行大批量樣品的測定時，試管法需要用到大量試管，滅菌時占用的空間較大，一般滅菌鍋無法滿足同時滅菌的需求，需要用到大容量或多個滅菌鍋進行滅菌。而微孔板法只需使用濾膜進行過濾滅菌，相對而言，效率更高。且使用濾膜過濾滅菌可以一定程度去除背景混濁，使試驗結果更穩定。培養方面，相對于試管法，微孔板將培養物置于微孔板中，體積縮小，占用空間更小，可于一個培養箱中進行大量樣品的培養。測定方面，試管法將各管用振蕩器混勻后，使用比色杯逐個管進行測定，需要耗費大量的時間。而微孔板直接將整板混勻后，置于酶標儀中測定，測定時間更加快速。故建議在進行大批量樣品的測定時，優先選用微孔板法進行試驗。在試驗成本方面，試管法每管需加入5 mL葉酸測定培養基，且對試管的需求量大且要求較高。微孔板法每孔只需150 μL培養基，微孔板為一次性耗材且每板可加96 個培養物，成本更低。

本研究通過對新標準兩種微生物法檢測乳粉中葉酸含量結果的準確度與重復性進行比較，兩種方法的準確度和重復性都較好。相對于試管法，微孔板法效率更高，成本更低，適用于大批量樣品的檢測需求。