生駝乳中金黃色葡萄球菌的熒光PCR檢測

文│韓涌（新疆維吾爾自治區烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心）

蔡擴軍（新疆維吾爾自治區烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心、新疆農業大學動物醫學學院）

徐敏（新疆維吾爾自治區烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心、烏魯木齊市奶業協會）

駝乳具有較高的營養價值和醫學保健功能，近年來，駝乳需求量呈現“爆發式”增長，供不應求，價格一路攀升。與此同時，駝乳質量安全受到廣大消費者的關注。金黃色葡萄球菌是一種常見的食源性致病微生物，可造成嚴重的食物中毒，嚴重危害消費者的身體健康。生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌污染報道較多，但駝乳中有關金黃色葡萄球菌的報道較少。為了解生鮮駝乳中金黃色葡萄球菌的污染狀況，本研究使用熒光PCR方法快速檢測生駝乳中的金黃色葡萄球菌，為預防和控制生駝乳中金黃色葡萄球菌引起的突發公共衛生事件提供技術支持。

一、材料與方法

1.主要試劑。7.5%氯化鈉肉湯購自北京陸橋技術股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；金黃色葡萄球菌熒光PCR檢測試劑盒購自深圳澳東檢驗檢測科技有限公司。

2.主要儀器。熒光PCR（7500）儀器購自美國ABI；細菌培養箱，生物安全柜。

3.金黃色葡萄球菌的分離、檢測。

（1）樣品采集。采集生鮮駝奶90份，樣品放入含有冰袋的運輸箱內，低溫運輸至實驗室。

（2）檢驗程序。

（3）操作步驟。增菌：按國家標準（GB/T 4789.10-2016）對生鮮駝乳進行前處理與增菌培養。無菌條件取25毫升駝奶樣品放入三角瓶，再加入225毫升7.5%氯化鈉肉湯，36±1℃培養18～24小時。

提取細菌基因組DNA：取增菌液1毫升加入EP管，10000轉/分鐘條件離心1分鐘，棄上清，根據細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取增菌液中細菌基因組DNA。

反應組份配制：按照金黃色葡萄球菌熒光PCR檢測試劑盒的說明書將樣品DNA、核酸擴增反應液、金黃色葡萄球菌反應液、S-Taq酶加至反應管，反應總體積為25微升，同時設置陰性和陽性對照。

PCR擴增：將配置好反應液的反應管置于熒光PCR儀器中，擴增程序為預變性95℃ 3分鐘、變性95℃ 5秒、退火/延伸60℃ 40秒，40個循環。

（4）結果描述及判定。陰性：無Ct值且無擴增曲線，表示樣本陰性或被檢測樣本核酸濃度含量低于1×102副本/毫升。

陽性：Ct值≤30，且出現明顯的指數增長期，表示樣本陽性。

可疑：檢測樣本30＜Ct＜35時，重復一次。如果Ct值仍小于35，且曲線有明顯的指數增長期，可報告樣本陽性，否則報告樣本陰性或者被檢測樣本核酸濃度含量低于1×102副本/毫升。

對照：陰陽性對照必須成立，否則此次實驗視為無效。

二、結果

該試驗陰陽性對照成立，本批次一共檢測樣品90份，其中11份陽性，陽性率11.1%。

三、討論

金黃色葡萄球菌的檢測方法包括傳統的分離生化鑒定、免疫學檢測、分子生物學檢測方法等，本研究采用PCR方法結合熒光探針的擴增檢測技術，操作簡單，有效防止污染，能對樣品中的金黃色葡萄球菌進行快速檢測。由于直接從奶中提取細菌基因組DNA技術不成熟，提取出來的基因組DNA質量不高，常常影響后續的PCR擴增結果，因此在本研究中，首先對駝乳中的金黃色葡萄球菌進行增菌，再提取菌液中細菌基因組DNA，保證細菌DNA模板的質量，同時避免駝乳中金黃色葡萄球菌含量極低而出現假陰性。

本研究結果顯示，生駝乳中金黃色葡萄球菌的污染率為11.1%，低于我國生牛乳中金黃色葡萄球菌的污染率，這可能與駱駝乳房炎患病率低于奶牛乳房炎有關。值得注意的是，本地人喜愛直接飲用發酵后的駝奶，而不像牛奶一樣煮沸后飲用，因此，加強對駝乳中金黃色葡萄球菌的監測及快速檢測具有重要的公共衛生學意義。