水稻土中土著細菌群落對重金屬Cd的響應

吳 玲

(1.常州工程職業技術學院檢驗檢測認證學院，江蘇常州 213164；2.南京師范大學地理科學學院江蘇省物質循環與污染控制重點實驗室，江蘇南京 210023)

隨著工農業的發展以及在人類活動的影響下，重金屬引起的土壤污染問題越來越嚴重。重金屬污染物易積累、難降解且毒性大，能夠破壞土壤生態環境及土壤結構，使土壤變得貧瘠，并導致土壤肥力下降[1]。土壤中的重金屬主要來源于風化作用、工業廢水、農業化學物的排放以及空氣中有毒氣體在雨水沖刷下與土壤的混合作用[2]；同時，土壤中的重金屬還能通過滲透作用回到周圍的大氣與水體中[3]。我國是水稻種植大國，水稻土遭受不同程度及不同種類的重金屬污染，其中，鎘生物毒性極強，是土壤中較為常見的重金屬污染元素，能夠被稻米富集，因此受到廣泛關注[4-5]。

土壤微生物能夠參與C、N等多種營養元素的循環過程，在維持土壤結構中發揮了重要的作用，高豐度的土壤微生物群落對于維持土壤功能具有重要的作用[6]。在重金屬的脅迫下，土壤中微生物量及活菌菌落數量明顯下降，且土壤微生物群落結構和功能均發生變化[7-8]。研究表明，與其他生物相比，土壤微生物對重金屬更加敏感，重金屬污染能夠干擾土壤微生物的生長、形態和代謝[9]。Ros等研究證實，Cd污染能影響半干旱土壤中的微生物活性、群落豐度與群落結構[10]；大量的室內與野外試驗證實，重金屬Cd能夠影響土壤微生物，并對土壤微生物產生最強烈的副作用，且不同的微生物對重金屬Cd具有不同的耐受性，微生物群落結構同時也是指示土壤重金屬污染的重要指標[11-12]。水稻土是具有干濕交替特征的特殊的農田土壤，研究不同濃度Cd對水稻土中土著細菌群落的影響是篩選土著耐Cd細菌的前提和基礎，而耐重金屬菌株的篩選是研究土壤微生物修復的重要環節。因此，本研究結果對當地土壤重金屬修復具有重要意義[13]。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集0～15 cm深度的自然生態系統土壤作為供試土，去除表面落葉、植被及顆粒物后，將土壤置于室內自然風干后研磨過篩，備用。

1.2 水稻盆栽試驗設置

在15 cm×20 cm(R×H)的塑料盆中裝土約 2 kg，將一定濃度的CdCl2·2.5H2O溶液加入盆中與土混合均勻，配制成Cd終濃度分別為0、20、40、80、160 mg/kg的土壤，每個濃度設置6個平行。在土壤中以1 ∶1 ∶1(質量比)施入N-P2O5-K2O肥料并澆水使土潤濕，放置平衡2周。2019年5月初在江蘇武進水稻研究所(中國常州)實驗室進行水稻育苗，選取苗齡2周，生長一致的秧苗移栽至塑料盆，放置于常州工程職業學院(中國常州)知行樓頂樓露臺，接受自然光照，用自來水澆灌，盆中保持 3～5 cm水層，模擬水稻150 d左右的生長周期。

1.3 水稻根際與非根際土的采集

在水稻生長的成熟期進行破壞性采樣，采集不同Cd含量(0、20、40、80、160 mg/kg)的根際與非根系水稻土共10個樣品，每個樣品采集3個平行樣。根據文獻，采用抖落法收集區分根際土和非根際土[14]。將采集的水稻根際與非根際土壤一部分用于土壤理化指標分析，一部分用于分子生態學研究。

1.4 水稻土理化性質的測定

pH值的測定：按2.5 ∶1的水土比用蒸餾水浸提水稻土，振蕩10 min并靜置30 min，用Mettler-Toledo S220-K-CN臺式pH計測定懸濁液pH值；無機氮的測定：按5 ∶1的水土比用2 mol/L KCl提取，并用Skalar San Plus連續流動分析儀(荷蘭Skalar分析儀器公司)測定無機氮的濃度；采用凱氏(Micro-Kjeldahl)定氮法測定總氮(total nitrogen，TN)含量；采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法測定總有機碳(total organic carbon，TOC)含量[15]。

1.5 宏基因組DNA的提取

采用FastDNA? SPIN Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals，美國)，參照使用說明書，將新鮮的水稻土樣品混勻，提取宏基因組DNA，并測定其濃度與純度。

1.6 高通量測序

使用通用引物515F(5′-G T G C C A G C M G C C G C G G-3′)和907R(5′-C C G T C A A T T C M T T T R A G T T T-3′)對水稻土中原核微生物16S rRNA基因進行擴增，對PCR擴增產物進行切膠分離，委托上海美吉生物(中國上海)進行高通量測序。

1.7 數據分析

利用SPSS 18.0軟件通過單因素方差分析(One-way analysis of variance)和Tukey多重比較評估不同Cd含量的水稻土理化指標之間的差異，P<0.05表示數據之間有顯著差異。利用美吉生信云平臺(http：//cloud.majorbio.com)將測序得到的OTU序列進行在線分析，主要包括微生物群落結構分析，香農指數(Shannon index)、Sobs指數及文庫覆蓋率(Coverage)的計算，水稻土Cd含量、理化指標與綱水平主要細菌類群豐度的Spearman相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同Cd含量的水稻土理化指標分析

2.2 不同Cd含量的水稻土高通量測序結果初步分析

不同Cd含量的水稻土中微生物16S rRNA基因Illumina高通量測序結果如表2所示， 10個水稻土樣品共獲得1 313 418條有效序列，且序列平均長度分別為376 bp。

表1 水稻根際與非根際土理化指標

表2 基于16S rRNA基因的水稻土樣品高通量測序結果

由OUT水平的Sobs稀釋曲線可得，水稻土樣品中的16S rRNA基因高通量測序所得的Sobs指數平均值在1 496～2 468之間，稀釋曲線趨向平坦，說明測序數據量合理(圖1-a)；Shannon指數表示菌群多樣性指數，數值越大，微生物多樣性越高，基于16S rRNA基因測序結果的Shannon指數在4.69～6.40之間，曲線趨向平坦，說明測序數據量足以反映水稻土樣品中大部分微生物的多樣性信息(圖 1-b)，且隨著水稻土中Cd濃度的上升，RS-160水稻樣品Shannon指數明顯低于其他組。Coverage值在0.97～0.98之間，說明測得的OTU基本能夠反映水稻土樣品中微生物群落結構組成(表2)。

2.3 不同Cd含量的水稻土中微生物群落結構變化與多樣性分析

對高通量測序獲得的所有OUT序列進行界(Kingdom)、門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)、種(Species)水平上的物種分類。通過16S rRNA基因測序結果可知，不同Cd含量的水稻土樣品中的原核微生物主要為細菌界，共有35個門，相對豐度前11位的細菌類群包括變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、藍細菌門、厚壁菌門、浮霉菌門、芽單胞菌門、己科河菌門、匿桿菌門，其中變形菌門在各水稻土樣品中均表現出優勢，其在水稻土樣品中的相對豐度平均值在32.1%～41.9%之間；共有94個綱，相對豐度前10位優勢菌群包括γ-變形菌綱、放線菌綱、subgroup-6、α-變形菌綱、擬桿菌綱、厭氧繩菌綱、δ-變形菌綱、生氧光細菌綱、梭菌綱、芽單胞菌綱(圖2)。

2.4 不同Cd含量的水稻土中微生物群落結構變化影響因素

3 討論與結論

土壤細菌是土壤中最重要的類群，對土壤中的重金屬污染物十分敏感[16-17]。當土壤中重金屬的濃度較高時，有些細菌數量會減少或絕滅，但耐重金屬細菌數量會增加并累積，因此，長期遭受重金屬污染的土壤細菌的群落數量與結構可能發生顯著的變化[18]。本研究通過基于16S rRNA基因的高通量測序技術分析可得，不同Cd含量的水稻土中原核微生物主要為細菌界以及其下35個門和94個綱，Sobs指數平均值在1 496～2 468之間，Shannon指數分布在4.69～6.40之間。由不同Cd含量的水稻土中門水平微生物群落分布圖可知，變形菌門在各水稻土樣品中均表現出優勢，并以γ-變形菌綱為主，其次為α-變形菌綱與δ-變形菌綱。變形菌門大多數兼性或者專性厭氧及異養生活，俎千惠等對不同緯度地區水稻土細菌群落的研究顯示，不同緯度的8個典型地區的水稻土均以變形菌門中的α和β分支為主[19]。