超聲波-微波輔助酶法提取葡萄皮渣水溶性膳食纖維的工藝研究*

陳彬 劉永衡 王麗華

（寧夏工商職業技術學院能源化工學院，寧夏銀川 750021）

2021年1 月，寧夏發布了《葡萄酒產業高質量發展實施方案》（以下簡稱“方案”），方案總體任務是爭取利用5—10年時間，使釀酒葡萄的種植規模達到100 萬畝，每年優質葡萄酒的產量達到3 億瓶以上。隨著葡萄釀酒基地不斷擴大、葡萄酒產量不斷提升，葡萄皮渣的產出量也不斷提高，據估計，目前每年產生約占葡萄加工量25%左右的皮渣。張瑩等研究表明，釀酒后的葡萄皮渣中含有大量花色苷、白藜蘆醇、膳食纖維等多種功能性成分，具有良好的醫療、保健作用。但在實際生產中，只有少量皮渣能夠實現再回收利用，絕大部分皮渣被作為飼料、肥料用于農業生產，相當一部分被當做垃圾扔掉，不但造成資源巨大浪費，還造成環境污染。因此，葡萄皮渣的回收利用是培育葡萄產業鏈競爭力、提升產業附加值的重要環節。

膳食纖維被稱為“第七大營養素”，在降糖減肥、降脂、預防心血管疾病等方面有一定的作用。有營養專家斷言，21 世紀的食品中富含膳食纖維食品將占據很大比重。膳食纖維有水溶性膳食纖維（SDF）和不溶性膳食纖維（IDF）兩種。孫艷等研究發現葡萄皮渣中總膳食纖維（TDF）含量較高，占皮渣干質量的75%，可溶性膳食纖維（SDF）含量占TDF 的15%。美國Riehard.E 和Donald.J 認為，TDF 中SDF 含量達到10%以上被稱作高品質膳食纖維，否則被稱作填充料型膳食纖維。

王娟等采用超聲微波輔助酶法對小米中SDF 進行提取，結果表明該法比傳統酶法提取的SDF 含量提高了46.88%。唐小閑等在提取蓮藕中膳食纖維的研究中發現，超聲波-微波輔助提取率比單一使用超聲波或微波高3～4 倍。這是因為物料經超聲波、微波處理后，表層結構被破壞，大分子物質變為小分子物質，體系變得更加均勻，更易溶出水溶性膳食纖維。酶法則可以軟化植物細胞壁，使有效成分最大限度溶出，提高得率。因此，本研究以賀蘭山東麓赤霞珠葡萄皮渣為原料，充分利用超聲波、微波、生物酶法的優點，采用正交試驗，建立對葡萄皮渣可溶性膳食纖維提取的最佳工藝組合，提高SDF 得率，以期為利用葡萄皮渣開發衍生品、培育關聯企業、提升產業附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤霞珠葡萄酒皮渣，為2020年11 月寧夏西夏王葡萄酒業（集團）有限公司葡萄酒生產結束后的皮渣；蛋白酶（酶活力＞10 萬U/g）、纖維素酶（酶活力＞400 U/g），上海源聚科技有限公司；無水乙醇，常熟鴻盛精細化工有限公司。

SCIENTZ IID 超聲波細胞破碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；DHG-9140A 電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；PL403-L 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-S6 電熱恒溫水浴箱，北京長源實驗設備廠；TGL16B 臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；YCYN-J1-3 微波爐，格蘭仕集團。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄皮渣預處理

將葡萄皮渣在60 ℃～70 ℃恒溫干燥箱內烘12 h，烘干后用粉碎機打成碎末后過篩（60 目），所得粉末裝瓶，4 ℃冰箱儲存備用。

1.2.2 水溶性膳食纖維的提取工藝

1.2.2.1 超聲波-微波法

稱取一定量葡萄皮渣，按1∶20 比例加入蒸餾水，采用超聲波-微波提取，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，蒸發濃縮，加入4 倍體積無水乙醇，常溫靜置1 h，離心，80 ℃烘干2 h，稱量。

1.2.2.2 酶法

稱取一定量葡萄皮渣，按1∶20 比例加入蒸餾水，調節pH，加入0.3%蛋白酶，50 ℃水浴鍋中酶解60 min，90 ℃水浴滅酶5 min，冷卻，加入不同質量濃度的纖維素酶處理不同時間，90 ℃水浴滅酶10 min，4000 r/min 離心10 min，取上清液，蒸發濃縮，加入4 倍體積無水乙醇，靜置1 h，低速離心，80 ℃烘干2 h，稱量。

1.2.2.3 超聲波-微波多酶聯合提取法

準確稱取2 g 預處理后的葡萄皮渣（精確至0.001 g）放進錐形瓶中，按照1∶20 比例加入40 mL蒸餾水。超聲波、微波處理一定時間后，調節pH值至7.0 左右，加入0.3%蛋白酶后50 ℃酶解60 min，之后于90 ℃～100 ℃水浴5 min 達到滅酶目的。自然冷卻后加入適量纖維素酶，置于一定溫度的水浴鍋中酶解一定時間，隨后置于90 ℃～100 ℃水浴中滅酶5 min 取出，冷卻至室溫。以4 000 r/min 離心20 min，取上清液加熱蒸發至原體積的1/3（乙醇沉淀時節省用量）。在濃縮好的溶液中加入4 倍體積無水乙醇，靜置60 min。4000 r/min 離心20 min，回收上清液，沉淀在80 ℃烘箱內烘干后稱量，所得即為可溶性纖維素（SDF）。

1.2.3 單因素試驗設計

在進行單因素試驗前，通過查閱文獻確定試驗其他條件為超聲波功率250 W、料液比1∶20、蛋白酶添加量3%。

準確稱取處理好的葡萄皮渣，每份2 000 g，加20 倍的蒸餾水，調節pH 值至7.0 左右，加入0.3%蛋白酶50 ℃水浴鍋中酶解60 min，90 ℃水浴滅酶5 min，冷卻，再分別研究纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時間、超聲時間以及微波時間5 個因素對水溶性纖維素（SDF）得率的影響。單因素條件分別設定為：纖維素酶添加量1.2 mg/mL、1.6 mg/mL、2 mg/mL、2.4 mg/mL；酶解溫度30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃；酶解時間80 min、90 min、100 min、110 min；超聲時間10 min、15 min、20 min、25 min；微波時間2 min、4 min、6 min、8 min，分別計算SDF 得率。同種條件進行3 次重復試驗，取平均值作為最終得率。

1.2.4 水溶性膳食纖維得率的計算公式

水溶性膳食纖維（SDF）得率計算公式：

式中：m—烘干后產品的質量，g；

M—葡萄皮渣總質量，g。

1.2.5 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，以超聲時間、微波時間、酶解時間、酶解溫度設計四因素三水平L9（34）正交試驗，每組試驗重復3 次。通過測定SDF 得率，篩選最佳工藝組合。正式試驗因素水平設計見表1。

表1 葡萄皮渣SDF 得率正交試驗因素水平

1.3 數據處理與分析

所有試驗重復3 次，利用IBM SPSS Statistics 19進行數據統計和方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 纖維素酶添加量對SDF 得率的影響

纖維素酶添加量對SDF 得率的影響結果如圖1所示。由圖1 可知，當纖維素酶添加量為1.6 mg/mL 時，SDF 得率達到最大值。纖維素酶添加量超過1.6 mg/mL 時，SDF 得率不再增加，其中添加量為2.0 mg/mL 時得率最小。

圖1 纖維素酶添加量對SDF 得率的影響

2.1.2 酶解溫度對SDF 得率的影響

酶解溫度對SDF 得率的影響結果見圖2。

圖2 纖維素酶解溫度對SDF 得率的影響

由圖2 可知，隨著溫度不斷升高，SDF 得率逐漸增多。當酶解溫度為60 ℃時，SDF 達到最大值13.88%。這是因為葡萄皮渣內除含可溶性纖維外，還含有大量糖類和不溶性纖維，當溫度過低時，糖類和不溶性纖維水解不完全。考慮到溫度過高時，SDF 等活性物質可能會受熱分解，反而造成SDF 得率降低，故選擇纖維素酶酶解溫度為50℃～60℃。

2.1.3 酶解時間對SDF 得率的影響

纖維素酶解時間對SDF 得率的影響結果見圖3。

圖3 酶解時間對SDF 得率的影響

由圖3 可知，當纖維素酶酶解時間為90 min時，SDF 達到最大值17.97%。當酶解時間從90 min 延長到110 min 時，SDF 得率急劇減少。這是因為酶解時間不足，糖類物質水解不充分；而酶解時間過長，其他物質的溶出使提取液變得黏稠，反而抑制酶的活性，使SDF 得率降低。因此，選擇纖維素酶酶解時間為90 min。

2.1.4 超聲時間對SDF 得率的影響

超聲時間對SDF 得率的影響結果如圖4 所示。

圖4 超聲時間對SDF 得率的影響

由圖4 可知，隨著超聲時間的延長，SDF 得率呈現先增大后減小的趨勢，其中在10 min～15 min之間SDF 得率增加幅度較大，在15 min 時達到最高，20 min 時，SDF 得率最小，保持平穩。這是因為隨著超聲時間的延長，葡萄皮渣中SDF 因超聲波的機械效應和空化效應更好地被溶解、溶出，使得SDF 得率逐漸增加。當SDF 充分浸出并達到飽和后，延長超聲時間反而會使其他雜質溶出，SDF 得率略有下降。

2.1.5 微波時間對SDF 得率的影響

基于上述單因素試驗結果，采用超聲波-微波輔助酶法提取可溶性膳食纖維。試樣經超聲波處理15 min 后，設計微波時間2 min，4 min，6 min、8 min，再用酶解法提取SDF，纖維素酶添加量1.6 mg/mL、酶解溫度60 ℃、酶解時間90 min，其他條件不變。

微博時間對SDF 得率的影響結果如圖5 所示。

圖5 微波時間對SDF 得率的影響

由圖5 可知，在試驗時間區間內，總體趨勢均表現為先增加后降低。當微波時間達到4 min 時，葡萄皮渣SDF 得率為17.12%，這可能是因為隨著時間的延長，葡萄皮中一些對溫度敏感的成分發生降解，從而使SDF 得率降低。

2.2 正交試驗結果

超聲波-微波輔助酶法提取葡萄皮渣水溶性膳食纖維正交試驗結果見表2。

表2 葡萄皮渣SDF 得率正交試驗結果

由表2 可知，影響葡萄皮渣可溶性膳食纖維（SDF）得率的大小順序為：D＞B＞C＞A，即酶解溫度＞微波時間＞酶解時間＞超聲時間。

正交試驗方差分析見表3。

表3 葡萄皮渣SDF 得率正交試驗方差分析

通過方差分析可知，纖維素酶酶解溫度和微波時間對葡萄皮渣SDF 得率的影響極顯著（P＜0.01），酶解時間對SDF 得率的影響具有顯著性（P＜0.05），而超聲時間對SDP 得率無顯著性差異。其最佳提取工藝組合為A1B3C1D1，即超聲時間13 min，微波時間5 min，酶解時間80 min，酶解溫度50 ℃。

為了驗證正交試驗的準確性，按照A1B3C1D1最佳組合工藝條件，進行3 次重復試驗，得到SDF 的平均得率為20.63%，其結果高于正交試驗中任意組合的SDF 得率，所以A1B3C1D1為超聲波—微波協同酶法提取葡萄皮渣SDF 所需的最佳工藝條件。

3 結論

單因素試驗結果表明，從葡萄皮渣中提取可溶性膳食纖維（SDF），纖維素酶酶解溫度、酶解時間、微波時間、超聲波時間是影響其得率的主要因素。在L9（34）正交試驗中，對可溶性膳食纖維（SDF）的提取條件進行了優化，確定最佳提取工藝參數為：超聲時間13 min，微波時間為5 min，酶解時間80 min，酶解溫度50 ℃。此條件下，SDF得率為20.63%，較單一使用酶法或超聲波-微波法提取的SDF 得率高，證實了超聲波-微波輔助多酶法提取葡萄皮渣SDF 的可行性，為葡萄皮渣的回收利用和深加工提供一定的理論依據。