膠原小肽鐵螯合物納米脂質體的制備及其在模擬胃腸道中的穩定性研究*

畢佳媛 陳夢倩 吳俊超 龔靜靜 徐源 胡新裕 林依婷 黃光榮*

（中國計量大學生命科學學院，浙江杭州 310018）

鐵是人體需求量最大，也是最容易發生代謝障礙的微量元素。如果機體缺鐵，將會引起多種疾病，如缺鐵性貧血（Iron Deficiency Anemia，IDA）、不孕不育等，可通過攝入含鐵量較高的食物或補鐵劑補充人體所缺的鐵元素。一般動物來源的血紅素鐵在人體內的吸收效率高，如牛肉中血紅素鐵的吸收率為22%，大大高于植物來源的1%～5%，但是血紅素鐵通常呈紅色，添加到食品中會影響產品的顏色甚至改變食品的某些性質，應用受到很大限制。因此，非血紅素類蛋白質酶促水解小肽鐵螯合物是該領域的研究新動向。有研究表明，以小肽為主要配體的微量元素螯合物能以整體形式被轉運，通過聚合作用或者形成離子網絡將螯合物截留在凝膠聚合物中，因而更有利于提高微量元素的吸收率。Ashmead 等認為氨基酸和小肽整合鹽可能利用氨基酸和小肽的吸收機制。因此，這些適口性好、副作用小、吸收率高的小肽鐵螯合物，是一種理想的補鐵劑。

膠原蛋白是一種具有生物功能的結構蛋白質，廣泛應用于醫藥、化妝品和食品工業領域。膠原蛋白提取的方法主要有熱水提取、酸法提取、堿法提取、鹽法提取和酶法提取。鱈魚是一種優質食物蛋白質來源，在加工過程中會產生大量副產物，其中鱈魚皮占加工量的7%～8%，而鱈魚皮干物質中膠原蛋白含量達50%以上，因此，鱈魚皮是優質膠原蛋白來源。

納米脂質體是一種類似生物膜結構的雙分子層囊泡，因其具有表面可修飾、載藥量高等優點而被廣泛應用。納米脂質體包埋技術相較于脂質體包埋技術具有生物相溶性好、生物利用度高、毒性低、成本低等優點，近年來眾多研究已將其用于生物活性肽和微量元素的載體。

本研究以鱈魚皮為研究對象，提取魚皮膠原蛋白，在膠原酶水解下得到膠原小肽，與鐵離子形成螯合物，使用納米脂質體包埋技術制備納米脂質體，并通過體外模擬胃腸道穩定性試驗探究其對螯合物的保護作用，以期為鐵代謝調節控制、鐵缺乏疾病的預防等提供一定的理論參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮鱈魚皮、干鱈魚皮；膠原酶（125 U/mg）、胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（10 000 U/mg），均為生化純；氯化亞鐵、七水硫酸亞鐵、抗壞血酸、鹽酸羥胺、鄰菲啰啉、菲洛嗪、乙酸銨、卵磷脂、膽固醇、乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、醋酸、異丙醇、鹽酸、磷酸二氫鉀等，均為分析純。

1.2 儀器與設備

AKTA Pure25 蛋白質純化儀，美國GE 公司；RV10 旋轉蒸發儀，德國IKA 公司；CT14RD 高速冷凍離心機，上海天美科技有限公司；Nano-S90高靈敏納米粒度分析儀，英國馬爾文公司；UV1000 紫外可見分光光度計，上海天美科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 膠原蛋白肽及其鐵螯合物的制備

參考柯梟等的制備方法，并略作修改。稱取一定量膠原蛋白于錐形瓶中，加入一定體積的去離子水（pH 5.5）溶解，使得底物質量濃度為8 mg/mL，加入膠原酶（酶底物比30 U/mg），置于恒溫搖床（33 ℃）中水解80 min，收集酶解液，沸水浴滅酶10 min，冰水冷卻，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，冷凍干燥得膠原蛋白肽。將其溶于去離子水中配成50 mL 6.7%肽溶液，加入10 mL 1% FeCl2（含1%抗壞血酸），室溫下磁力攪拌2 h，添加6 倍體積的無水乙醇洗滌，10 000 r/min 離心10 min，重復洗滌3次，收集沉淀，冷凍干燥得鐵螯合物。

1.3.2 水解物分子量分布

用Sephadex G-15 凝膠柱（10 mm × 300 mm）對膠原蛋白肽進行分離，流速0.5 mL/min，檢測波長220 nm，以氧化型谷胱甘肽（分子量613）為分子量標準品。

1.3.3 納米脂質體制備

將卵磷脂和膽固醇溶于30 mL 乙醇中，加熱超聲溶解，在一定溫度下進行旋轉蒸發，除去有機溶劑，待瓶壁形成一層致密的薄膜，稱取螯合物用30 mL 去離子水溶解，水浴預熱后倒入瓶中與膜混合，經過加入水相介質水化30 min，移出溶液，超聲10 min，分別過孔徑0.45μm 濾膜和0.22μm 濾膜，得納米脂質體懸浮液。

1.3.4 體外模擬胃腸液消化

根據WANG 等方法，制備人工模擬胃液和人工模擬腸液。分別取6 mg納米脂質體和螯合物溶液置于120 mL 摸擬胃液中，在37 ℃下磁力攪拌，溶解后采用鄰菲羅啉法測定總鐵含量。然后分別于0.5h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、4.0 h取樣，沸水浴10 min 滅酶，10 000 r/min 離心10 min，以菲洛嗪法測定上清液中游離鐵含量。在4 h時用NaOH調pH 值為7 終止反應，轉移至腸液中，37 ℃磁力攪拌，接上時間，于4.5 h、5.0 h、5.5 h、6.0 h 取樣，沸水浴10 min 滅酶，10 000 r/min 離心10 min，以菲洛嗪法測定上清液中游離鐵含量。

1.4 測定方法

1.4.1 總鐵含量

采用鄰菲羅啉法測定總鐵含量。取適量樣品溶液于50 mL 容量瓶中，依次加入6 mol/L 鹽酸1 mL，10%鹽酸羥胺1 mL，0.5%鄰菲羅啉2 mL，pH 值4.6乙酸銨緩沖液5 mL，以去離子水稀釋至刻度，搖勻，反應15 min，以水為空白對照，在510 nm 處測定吸光度值。用硫酸亞鐵為標準品，繪制標準曲線。

1.4.2 鐵離子釋放率

以菲洛嗪法測定胃腸液穩定性試驗中的游離鐵離子含量。樣品以鄰菲羅啉法測定總鐵含量，以菲洛嗪法測定游離鐵離子含量。菲洛嗪法簡要步驟為：取1 mL 樣品溶液，加入2 mL 去離子水，用1 mol/L HCl溶液調pH值5.4～6.0，加入0.2 mL 5 mmol/L菲洛嗪溶液，反應30 min，于562 nm 處測定吸光度值，空白組用去離子水代替樣品溶液，以硫酸亞鐵為標準品，繪制標準曲線。鐵離子釋放率以游離鐵離子占總鐵含量的百分比表示。

1.4.3 包封率

取螯合物納米脂質體混懸液，加入等體積的去離子水，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用鄰菲羅啉法測定鐵含量，用空白納米脂質體為對照，測定510 nm 處的吸光度值，分別記錄吸光度值。代入標準曲線，得游離鐵離子的質量濃度C1。離心取沉淀，同法測定游離鐵離子質量濃度，以空白納米脂質體為對照。代入標準曲線，得包埋鐵離子的質量濃度C2。根據公式得包封率：

1.4.4 納米脂質體粒徑

采用Nano-S90高靈敏納米粒度分析儀測定。

1.5 數據處理

所有測定均重復3 次，結果以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 膠原蛋白肽分子量分布

以干魚皮制備得到的膠原蛋白和以鮮魚皮制備得到的膠原蛋白，分別用膠原酶水解后得到的肽，經過SepHadex G-15 凝膠柱洗脫分離，分子量分布情況如圖1 所示。由圖1 可知，干魚皮的膠原蛋白肽水解組分有3 個吸收峰，鮮魚皮的膠原蛋白肽水解物有2 個吸收峰。對比干、鮮魚皮的膠原蛋白肽水解物的吸收峰與氧化型谷胱甘肽（分子量613，保留時間65 min）色譜圖，可以看出干、鮮魚皮膠原蛋白肽的水解物相對分子量均小于1 000，低于613 的占絕大部分，而且鮮鱈魚皮水解得到的肽相對分子量小于干魚皮水解肽。因此后續試驗均采用鮮鱈魚皮進行提取。

2.2 納米脂質體制備條件優化

納米脂質體技術是一種利用磷脂雙分子層生物膜結構的脂質體技術，可以用來包埋生物活性物質，提高其生物利用率。本文采用薄膜分散法制備納米脂質體，研究了加樣量、膽脂比、pH 值和溫度等4 個因素對膠原肽螯合鐵納米脂質體包封率的影響，結果分別見圖2～圖5。

由圖2 可知，隨著膠原肽鐵螯合物加樣量（30 mL 體系中）的增加，納米脂質體的包封率隨之增大，當膠原肽鐵螯合物的加樣量為6 mg 時，包封率達到最高，隨著加樣量進一步增加，包封率顯著降低。因此確定下一步加樣量優化范圍為5 mg～7 mg。由圖3 可知，在膽脂比0.25～0.35 范圍內，納米脂質體的包封率隨著膽脂比升高而增大，在膽脂比為0.35 時達到最大，之后開始快速降低，膽脂比為0.35 時最佳。由圖4 可知，在pH 值4.0～6.0 范圍內，納米脂質體包封率隨pH 值升高而增大，在pH 值為6.0 時達到最大，之后開始降低，這可能是由于膠原肽鐵螯合物在弱酸性時與脂質體結合效果較好的原因。由圖5 可知，隨著制備過程中水合溫度的升高，包封率增大，40 ℃時達到最大，當溫度超過40 ℃時呈快速下降趨勢。溫度適當增大有利于脂質體內部膠原肽鐵螯合物和磷脂等形成均一穩定的結構，但是溫度過高，膠原肽螯合鐵納米脂質體的穩定性降低，包封率有所下降，因此確定40 ℃時為適宜溫度。

通過以上單因素試驗，初步確定響應面試驗的4個因素的中心點值分別為：加樣量6 mg，膽脂比0.35，pH 值6.0，溫度40 ℃。響應面優化因素水平設計和試驗結果如下頁表1 所示。用Design-expert 8.0 對結果進行方差分析，結果見表2。結果表明對包封率影響顯著因素的有溫度（A）、加樣量（B）和膽脂比（C），同時各因素間的交互作用并不明顯。

表1 納米脂質體包封率響應面試驗結果

表2 響應面法方差分析結果

根據Design-expert 8.0 分析得出螯合的最優條件為：溫度39.9 ℃，膽脂比0.366，加樣量5.6 mg，pH 值6.0，此條件下包封率為69.033%。同時，在溫度40 ℃，膽脂比0.37，加樣量5.6 mg，pH 值6.0條件下，做3 次驗證試驗，平均包封率為70.1%，與預測值比較接近。

2.3 納米脂質體粒徑

對制備得到的納米脂質體粒徑進行測定，空白納米脂質體平均粒徑為138.7 nm，在納米級范圍內粒徑分布范圍較窄、分布區域比較集中，表明所制備的空白納米脂質體是以納米結構體的形式均勻分布。螯合物納米脂質體平均粒徑為192.3 nm，相比于空白脂質體，螯合物的載入增大了粒徑值，加寬了粒徑分布范圍，分布區域較分散，說明螯合物的載入會影響其均勻分布。

2.4 在模擬胃腸液中的穩定性

試驗比較了膠原肽鐵螯合物及其納米脂質體在模擬胃液和腸液中的穩定性，結果如圖6 所示。從圖6 可以看出，相同條件下，膠原肽鐵螯合物的鐵離子釋放率高于膠原肽螯合鐵納米脂質體，也就是說納米脂質體對膠原肽鐵螯合物具有一定保護作用，減緩了其釋放速率。同時比較了膠原肽鐵螯合物與其他氨基酸鐵螯合物（以甘氨酸鐵螯合物為對照）在模擬胃液和腸液中的穩定性，試驗結果如下頁圖7 所示。圖中0 h～4 h 是在胃液中測得，4 h～6 h是在腸液中測得，即模擬了食物在人體內消化的停留時間。由圖7 可知，在0 h～4 h 模擬胃液環境下，膠原肽鐵螯合物的鐵離子釋放最快，甘氨酸螯合鐵的鐵離子釋放最慢，且三者的釋放率隨時間變化波動不大。在第4 h 轉換為模擬腸液環境時，三者的鐵離子釋放率均急劇增長，這可能是由于pH 值變化導致的。在4 h～6 h內三者的釋放率隨時間變化波動不大，但是膠原肽鐵螯合物納米脂質體的釋放率最低，膠原肽鐵螯合物的釋放率最高，甘氨酸螯合鐵的釋放率介于中間，由此進一步看出納米脂質體更穩定，對螯合物具有保護作用，具有緩釋作用。

3 結論

以鮮魚皮提取的膠原蛋白比干魚皮提取的膠原蛋白在膠原酶水解后具有更低的分子量。以膠原蛋白肽與亞鐵離子螯合，得到膠原蛋白肽鐵螯合物。通過單因素和響應面試驗優化得到制備膠原蛋白肽鐵螯合物納米脂質體的最佳工藝參數為：溫度40 ℃，膽脂比0.37，加樣量5.6 mg（30 mL 體系中），pH值6.0，制備得到的螯合物納米脂質體平均粒徑為192.3 nm。模擬胃腸道消化穩定性試驗結果表明，納米脂質體對于肽鐵螯合物有較好的保護作用和緩釋作用。本研究結果為鐵代謝調節控制、鐵缺乏疾病的預防等提供了一定的理論參考價值。