土霉素生產優良菌株的篩選與發酵條件優化

王子竹， 王紅英， 劉進文， 尹麗景， 錢斯日古楞*

1.大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034；2.內蒙古華曙生物科技有限公司，內蒙古 通遼 028400

土霉素(Oxytetracycline，OTC)又稱地霉素、氧四環素和5-羥基四環素，是一種化合物(分子式為C22H24N2O9)，其相對分子質量為460.44。土霉素為淡黃色晶體，酸堿的兩性分子，微溶于水。土霉素具有廣譜抗菌作用，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有較好的抑制生長效果。土霉素的抗菌機制主要是通過與細菌核糖體的30S小亞基結合，干擾氨酰-tRNA與核糖體的結合，阻礙細菌蛋白合成進程，從而達到抑制細菌繁殖的效果。由于土霉素毒副作用小，生產率高，因此在醫療，尤其是在畜牧業的醫療中廣泛應用[1-3]。

要提高土霉素產量，除了要求生產菌株具備優良的生產性能外[4]，還必須要有合適的培養基。不同的菌株對培養基組分要求不同，同為龜裂鏈霉菌屬的不同菌株對培養基有著不同的需求。因此，篩選出土霉素高產菌株后還需對培養基進行優化，提高發酵產量，達到最高生產效率，同時盡量降低生產成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

菌種是實驗室保存的土霉素產生菌(土壤來源)。

1.1.2試劑

土霉素標準品(HPLC≥95%)，北京索萊寶科技有限公司銷售；葡萄糖、草酸、硫酸銨、碳酸鈣、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵、氯化鈉、瓊脂粉、氫氧化鈉、氯化鈷、硫酸鋅、鹽酸、氯化鐵等均國產分析純；可溶性淀粉、麩皮、黃豆餅粉、玉米漿、小米、蛋白胨、玉米淀粉、3，5-二硝基水楊酸(DNS)試劑等均為本地試劑公司銷售的實驗用品。

1.1.3儀器

TU-1901紫外分光光度計，北京譜析通用儀器公司；MULTIPLEX1R32R大型離心機，賽默飛世爾科技公司；霉菌培養箱MJ-16085-III，上海新苗醫療器械制造有限公司；ZHWY2102C立式雙層恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.1.4培養基

1.1.4.1土霉素生產菌種活化培養基

(1) 菌種活化培養基1號(g/L)：可溶性淀粉25、酵母粉2、蛋白胨1、氯化鈉2.5、硫酸鎂2.5、磷酸二氫鉀0.5、磷酸氫二鉀0.5、瓊脂粉18、去離子水，調pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

(2) 菌種活化培養基2號(g/L)：麩皮65、瓊脂粉20、去離子水，調pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

1.1.4.2土霉素生產菌種種子培養基[5,6]

(1) 菌種種子培養基1號(g/L)：葡萄糖10、蛋白胨3、氯化鈉2.5、碳酸鈣0.2、1%小米浸提物、去離子水，調pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

(2) 菌種種子培養基2號(g/L)：玉米淀粉30、黃豆餅粉3、硫酸銨4、碳酸鈣5、玉米漿4、氯化鈉5、磷酸二氫鉀0.1、去離子水，調pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

(3) 菌種種子培養基3號(g/L)：可溶性淀粉30、玉米漿5、氯化鈉2、硫酸銨6、碳酸鈣3、磷酸二氫鉀4、去離子水，調pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

1.1.4.3土霉素生產菌種發酵培養基[6,7]

(1) 發酵培養基1號(g/L)：玉米淀粉150、黃豆餅粉20、碳酸鈣12、硫酸銨14、氯化鈉4、玉米漿4、磷酸二氫鉀0.1、氯化鈷0.01、消泡劑0.1、去離子水，調pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

(2) 發酵培養基2號(g/L)：玉米淀粉120、黃豆餅粉20、碳酸鈣15、硫酸銨15、氯化鈉4、玉米漿10、磷酸二氫鉀0.1、氯化鈷0.01、消泡劑0.1、淀粉酶0.12、去離子水，調pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

(3) 發酵培養基3號(g/L)：玉米淀粉90、黃豆餅粉30、碳酸鈣9、硫酸銨10、氯化鈉25、玉米漿10、磷酸二氫鉀0.5、硫酸鋅0.02、去離子水，調pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1土霉素生產菌的分離、純化

將實驗室保存的土霉素產生菌斜面或茄子瓶孢子刮下加入到裝有無菌水和玻璃珠的三角瓶中，在恒溫震蕩搖床200 r/min震蕩5 min后得分散的孢子液，調整濃度為105CFU/mL；涂布平板后，先在37 ℃條件下培養3 d，然后轉到30 ℃，繼續培養1 d，得到分散生長的單菌落，觀察其形態[4,8-9]。而后將不同的單菌落上的孢子分別制成低濃度的孢子液，涂布平板，得到純化單菌落菌株[10-12,14]。

1.2.2土霉素生產菌株的抑菌活性檢測

在37 ℃平板培養3 d的單菌落，用滅菌的打孔器將單菌落連同瓊脂取出后，置于均勻涂布八疊球菌菌懸液的平板上，在30 ℃條件下培養1 d，測量其抑菌圈直徑，通過對抑菌圈大小的統計和分析，比較不同菌株的抑菌活性[6,12-13,15-16]。

1.2.3菌株產生土霉素效價的測定

將待測土霉素的發酵液用草酸酸化至pH 1.5～1.7，靜置5 min后過濾；取1 mL濾液與9 mL 0.01 mol/L鹽酸和10 mL 0.05%氯化鐵溶液混合，搖勻，靜置20 min后，測定其OD480 nm，經過公式計算得到效價。1 mL濾液與19 mL 0.01 mol/L鹽酸混合，搖勻，靜置20 min，作為對照組[17,18]。

土霉素標準曲線的制備是以土霉素標準品為標準物，鹽酸和氯化鐵配制的溶液為顯色劑，得到的回歸方程式為y=8 763.9x+149.32，R2=0.993 2。

效價計算公式：

土霉素總效價=土霉素效價×稀釋倍數

1.2.4土霉素生產菌株的菌種活化

將在活化培養基2號中保存的菌株B用無菌水配置成一定濃度的孢子液，在菌種活化培養基1號上均勻涂布，在37 ℃條件下培養3 d后轉到30 ℃條件，繼續培養1 d，獲得活化的土霉素生產菌株B。

1.2.5土霉素生產菌最適種子培養基

將一定濃度菌株B的孢子液取出3份2 mL，分別轉接到裝有35 mL種子培養基1號、2號和3號的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min條件下搖瓶培養1 d。各取出2 mL，分別轉接到裝有35 mL發酵培養基1號的三個250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min培養。在培養期間每2 d測一次發酵液中的土霉素效價，觀察種子培養基種類對土霉素產量的影響[3,9]。

1.2.6土霉素生產菌最適發酵培養基

(1) 最適發酵培養基的選擇

從土霉素生產菌株B孢子液中吸取2 mL轉接到裝有35 mL種子培養基2號的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min條件下培養1 d后，分別取2 mL種子液轉接到裝有35 mL發酵培養基1號、2號和3號的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min條件下搖瓶培養。在培養過程中每2d測一次發酵液中的土霉素效價，觀察發酵培養基種類對土霉素產量的影響。

(2) 淀粉酶預處理發酵培養基對土霉素發酵的影響

淀粉酶(3 700 U/g)與天然成分(玉米淀粉、黃豆餅粉、玉米漿)按1∶1 250的比例混合，加入適量去離子水，調節pH 6.5，在45 ℃，160 r/min條件下，搖瓶反應3 h后，再添加其它發酵培養基成分和去離子水，高溫高壓滅菌，使預處理所添加的淀粉酶失活。

將菌株B孢子液吸取2 mL，加入到裝有35 mL種子培養基2號的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min條件下，搖瓶培養1 d。從中吸取2份2 mL，分別轉接到裝有35 mL經過淀粉酶預處理的發酵培養基2號的250 mL三角瓶和裝有35 mL未經淀粉酶處理的發酵培養基2號的250 mL三角瓶中對照，均在30 ℃，220 r/min條件下，搖瓶培養。在培養過程中每2 d測一次發酵液中的土霉素效價，觀察淀粉酶預處理的發酵培養基對土霉素產量的影響。

1.2.7發酵過程中的淀粉酶活力與菌株產生土霉素的關系

將2 mL的三種不同種子液分別轉接到裝有35 mL發酵培養基2號的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min條件下搖瓶培養。測定不同時期發酵液中的淀粉酶活力和土霉素效價，觀察淀粉酶活力與土霉素產量的關系。

淀粉酶活測定采用DNS法[19,20]，以無水葡萄糖為標準物，DNS試劑為顯色劑，在540 nm處測定其吸光值，得到的回歸方程式為y=7.816 7x+0.018 4，R2=0.998 1。

取10 g可溶性淀粉，加入到100 mL容量瓶定容，配成100 mg/mL的淀粉溶液，將待測土霉素的發酵液倒入離心管中，6 000 r/min條件下離心10 min。取1.5 mL淀粉溶液加入到試管中,再取1 mL上清液加入到試管中，30 ℃水浴加熱10 min后，取0.5 mL水解液加入到25 mL試管中，再向試管中加入1.5 mL DNS試劑和1.5 mL去離子水，沸水浴 5 min，冷卻后定容至25 mL，測OD540nm，經過公式計算得到淀粉酶活力。取0.5 mL淀粉溶液、1.5 mL DNS試劑和1.5 mL去離子水，沸水浴 5 min，冷卻后定容至25 mL，作為對照組。

淀粉酶活力定義為，在30 ℃、pH 6.0的條件下，每分鐘水解淀粉生成1 mg還原糖所需的酶量為一個活性單位(U)。

10——發酵液與底物反應時間/min

0.5——水解液體積/mL

1——發酵液體積/mL

2 結果與討論

2.1 土霉素生產菌的分離、純化與抑菌活性

2.1.1土霉素生產菌株的形態特征

將斜面保存的菌株孢子用無菌水制備均勻孢子液，進行稀釋后，涂布平板分離，并觀察其產生菌落的形態特征，結果如圖1。

在分離平板上出現了三種不同特征的菌落，菌落A、菌落B、菌落C。對三種菌落的孢子再次進行稀釋、涂布后得到單一菌落，結果如圖2。

菌落A密實潔白，質地硬，表面為車輪狀，孢子豐滿；菌落B密實，棕褐色，質地硬，表面為車輪狀，孢子量不豐滿；菌落C密實，深褐色，質地硬，表面為車輪狀，孢子較少。

2.1.2土霉素生產菌株的抑菌活性

從供試混合菌中分離得到的三種菌落(A,B,C)中的菌株在涂布八疊球菌培養基上，能夠形成明顯的抑菌圈，結果如圖3和表1。

通過測量產生抑菌圈大小，統計和分析后發現，菌株B產生的抑菌圈平均直徑最大為27.25 mm，且效果最穩定，抑菌圈邊緣清晰，對八疊球菌抑菌活性最明顯；菌株C雖抑菌圈邊緣清晰，有明顯抑菌活性，但抑菌效果不穩定；菌株A抑菌圈邊緣模糊，抑菌圈平均直徑較小，且抑菌效果不穩定。因此將菌株B作為后續試驗的出發菌株。

Ⅰ 分離平板

Ⅱ 三種不同菌落的形態(A,B,C)

菌落 A

菌落 B

菌落 C圖2 菌株菌落特征

菌落 A

菌落 B

菌落 C圖3 土霉素生產菌株產生的抑菌圈

表1 菌株(A,B,C)的抑菌圈直徑

2.2 土霉素生產菌(菌株B)在未經優化生產條件下的最適發酵時間

將菌株B用種子培養基2號制成種子液，轉接到發酵培養基2號中，在一定條件下搖瓶培養，每2 d測定其土霉素效價，結果如圖4。

圖4 培養時間對菌株產生土霉素的影響

由種子培養基1號制成的菌株B種子液，在發酵培養基2號上進行培養時，培養前4 d土霉素累積量最快，第4 d后進入緩慢增長期，在第8 d時達到最高8 943 U/mL。因此菌株B在發酵培養基2號上產生土霉素的最適培養時間確定為8 d。

2.3 土霉素生產菌(菌株B)的最適種子培養基

將菌株B分別用種子培養基1號、2號和3號制成3種種子液，再分別轉接到發酵培養基1號中，在一定條件下搖瓶培養8 d，發酵過程中土霉素產量與時間的關系如圖5所示。

圖5 不同種子培養基對發酵產生土霉素的影響

由圖5可見，通過對土霉素效價變化比較發現，三種種子培養基培養的菌株B在發酵培養的前4 d，土霉素均大量累積，而第4 d到第6 d累積速度變慢，但第6 d后土霉素累計速度再次加大，出現峰值。種子培養基1號中含有葡萄糖和小米，葡萄糖較淀粉更易利用，因此，轉接時種子培養基1號中的菌株發育程度更高，轉接到發酵培養基進行發酵培養時可以更短時間進入次級代謝，積累土霉素。小米中含有大量天然淀粉，刺激菌株產生淀粉酶，提高菌株產淀粉酶活力，后續發酵過程提高菌株利用淀粉能力。

種子培養基1號培養的菌株B發酵積累土霉素量均比其它兩種種子培養基培養的菌株B高，效價為9 533 U/mL，提高了6.59%。因此將種子培養基1號為菌株B發酵生產土霉素的最適種子培養基。

2.4 土霉素生產菌(菌株B)的最適發酵培養基

將菌株B用種子培養基1號制成種子液，取三份2 mL，分別轉接到發酵培養基1號、2號和3號中，在同一條件下搖瓶培養，每2 d測定其土霉素效價，結果如圖6所示。

圖6 不同發酵培養基對菌株產生土霉素的影響

如圖6所示，由種子培養基1號制成的菌株B種子液，在發酵培養基1號、2號和3號中培養時，土霉素效價均隨發酵時間延長而增加。其中菌株在發酵培養基2號中培養的前2 d，土霉素累積速度較慢，但從第2 d開始土霉素累積量增加，速度加快，且趨勢穩定；而發酵培養基1號和3號的土霉素積累量隨培養時間增加，但均比發酵培養基2號積累的土霉素少，發酵培養基2號中最終效價為10 247 U/mL，又提高了7.49%，因此發酵培養基2號為菌株B的最適發酵培養基。

發酵培養基2號中成分與1號相比，玉米漿濃度更大，玉米淀粉濃度更小；與3 號相比，玉米淀粉濃度更大，黃豆餅粉濃度更小。培養基中碳氮比最高的1號產量最低，碳氮比最低的2號產量最高。從這個角度來看，碳氮比低更適合菌株B發酵生產，但是具體的比例在什么范圍內最好，碳源和氮源的濃度在何范圍內更適合生產還需要進一步實驗。

將菌株B用種子培養基1號制成種子液，取兩份2 mL，分別轉接到未經淀粉酶預處理的發酵培養基2號和經淀粉酶預處理的發酵培養基2號中，在同一條件下搖瓶培養，每2 d測定其土霉素效價，結果如圖7所示。

對發酵培養基2號成分的淀粉酶預處理研究發現(見圖7)，經淀粉酶預處理的發酵培養基2號中，菌株B對土霉素累積速度明顯比未經淀粉酶處理的快，而且在培養第6 d時效價達到最高11 023 U/mL，又提高了7.57%，并趨于平穩。

目前土霉素生產菌株普遍存在產淀粉酶能力較低，淀粉利用率較弱的現象，發酵培養基經過淀粉酶預處理，其碳源被水解更容易被利用，從而大大提高物料利用率，縮短發酵生產土霉素時間。因此，發酵培養基配制前，對天然成分進行淀粉酶預處理，可增加土霉素產量。但是發酵培養基預處理時的淀粉酶與天然成分的比例和處理時間仍需進一步研究。

但是生產的前6 d產量持續上升，因此峰值在4 d～6 d區間內出現，為得到更加準確地生產時間，下一步應從第4 d開始，每2 h測一次效價，進一步得到最佳發酵時間。

2.5 菌株產淀粉酶能力與其土霉素產量的關系

將菌株B用種子培養基1號制成種子液，轉接到發酵培養基1號中，在一定條件下搖瓶培養8 d，每2 d測定其發酵液中的土霉素效價和淀粉酶活力，結果如圖8。

圖8 菌株土霉素產量與其淀粉酶活力的關系

由圖8可見，由種子培養基1號制成的菌株B種子液，在發酵培養基1號上進行培養，通過比較其中土霉素效價和淀粉酶活力的變化趨勢發現，從發酵第2 d開始菌株土霉素積累加速，第4 d時進入緩慢期，但從第6 d起又進入土霉素積累快速期。與之相比淀粉酶的酶活從種子液到發酵結束，保持一定水平，沒有明顯的波動。但是淀粉酶預處理發酵培養基可以明顯提高產量，因此需要進一步研究淀粉酶與土霉素生產之間的關系。本實驗中只研究了發酵液中淀粉酶活力變化與土霉素產量變化之間的關系，下一步應對種子液中淀粉酶活力與土霉素最終產量之間的關系進行研究。

3 結論

(1) 在最適種子培養基選擇實驗中發現，以種子培養基1號作為種子培養基時，發酵產生土霉素的產量更高，并且種子培養基1號具有配方簡單，易配制等優點，綜合分析后，種子培養基1號為最適種子培養基。在最適發酵培養基的選擇實驗中，發酵培養基2號為最適發酵培養基，效價達到10 247 U/mL。而且發酵培養基2號經淀粉酶預處理可以有效縮短發酵時間至6 d，效價達到11 023 U/mL。因此，綜合考慮生產成本、生產效益等因素，菌株B在經過淀粉酶預處理的發酵培養基2號中發酵培養6 d為最佳。

(2) 發酵液中的淀粉酶活力的變化與菌株土霉素產量的變化沒有明顯關系，土霉素產量增加加快時，淀粉酶活力沒有相應增加。

(3) 在未優化的生產條件下發酵培養，原混合菌產量為6 430 U/mL，菌株B產量為8 943 U/mL，高于原混合菌39%。菌株B在經過淀粉酶預處理的發酵培養基2號中發酵培養6 d的產量為11 023 U/mL，較未分離純化原菌株效價提高了71.43 %。由此可見，通過篩選優良菌株、優化生產條件提高微生物次級代謝產物的方法是經濟有效的。