分子擁擠增強DNA-AgNCs的抗真菌能力及其在柑橘保鮮中的應用

杜 寧，陳 旭，劉海燕, ，許文濤,

（1.華北理工大學公共衛生學院，河北唐山 063210；2.中國農業大學營養與健康系，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100083；3.中國農業大學食品科學與營養工程學院，農業部農業轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083）

柑橘（Citrus reticulataBlanco）是蕓香科柑橘屬植物，我國種植面積和產量位居世界第一，在貯藏階段容易受到多種真菌侵染導致損失率高達20%～25%[1]。傳統的保鮮包裝不易降解，對環境造成嚴重污染，進而促進了新型可降解涂膜保鮮技術的開發。淀粉和殼聚糖因其成本低、可降解和良好的生物相容性，被廣泛應用在面包[2-3]、果蔬[4-5]、肉類[6-7]等食品的包裝中，但單一的淀粉-殼聚糖包裝膜的抗菌能力較弱，需要引入銀納米簇（AgNCs）、納米ZnO、植物精油等抗菌材料來增強淀粉-殼聚糖包裝膜的抗菌性能。

AgNCs是直徑小于2 nm的團簇，主要通過破壞細菌形態影響胞內代謝[8]，不僅對細菌有較好的抗菌效果，對白色念珠菌[9]和曲霉[10]等真菌也有較強的抗菌作用，且添加AgNCs的薄膜還能抑制荔枝[11]、甘蔗[12]采后霉菌繁殖延長貨架期，對多種食物都有良好的保鮮效果[13]。但單純的AgNCs性質不穩定，在DNA模板的加持下合成的AgNCs（DNA-AgNCs）具有穩定的熒光和抗菌性能[14]。

細胞內環境被核酸、蛋白質、多糖、小分子、各種離子等密集地占據，這種現象稱為分子擁擠，分子擁擠對分子結構和細胞內各種生命活動有高效精確的調控作用[15-16]。平均分子量為200的PEG溶液（PEG 200）與核仁內的環境相似，常用來體外模擬分子擁擠[17]，以穩定DNA結構，確保DNA-AgNCs不受外界干擾[18]。加之PEG有微弱的抗菌作用[19]，因此，在DNA-AgNCs合成時加入PEG 200，可以增強DNA-AgNCs的穩定性和抗菌能力。

本研究選用PEG 200模擬胞內分子擁擠環境來合成DNA-AgNCs，以擴展青霉（Penicillium expau sum）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、禾谷鐮刀菌（Fusa rium graminearum）、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）為模型來評估其抗真菌能力，再以淀粉和殼聚糖為基質制備復合薄膜，并通過涂膜保鮮對接種擴展青霉孢子的柑橘進行青霉病防治效果的研究，以期開發一種環境友好的柑橘保鮮涂膜。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柑橘 購自湖北省咸豐縣，果實大小均勻，成熟程度一致，無機械損傷和病害，采摘后立即運回實驗室；擴展青霉、黃曲霉、禾谷鐮刀菌、串珠鐮刀菌均為中國農業大學營養與健康系功能核酸實驗室保藏；硝酸銀、硼氫化鈉 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰醋酸 分析純，北京化工廠；甘油

分析純，上海麥克林生化科技有限公司；殼聚糖美國Sigma公司；食用玉米淀粉 福建古田榮昌貿易有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDB）、馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDA） 上海索萊寶生物科技有限公司。

GL-3250A磁力攪拌器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ-600VD超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司；TA.HD plusC質構儀 英國Stable Micro System公司；OCA25接觸角測量儀 德國Dataphysics公司；Amix熒光生物成像系統 美國Spectral Instruments Imaging公司；ELX-800多功能酶標儀 德國Biotek公司；SU5000掃描電鏡 日本日立公司；DMIL LED熒光倒置顯微鏡 德國徠卡公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA-AgNCs的制備 根據Yeh等[20]的方法，將序列（5'-CCCCCCCCCCCC-3'）與AgNO3溶液混合，室溫孵育30 min，然后加入新鮮配制的NaBH4溶液，振蕩1 min。最終濃度為DNA 15 μmol/L，AgNO3180 μmol/L，NaBH4180 μmol/L，pH6.8的PB緩沖液20 mmol/L。在混合液中加入50% PEG 200溶液模擬分子擁擠環境（記為Ag+PEG），以不加PEG溶液做對照（記為Ag），使用前在4 ℃避光條件下反應12 h。

1.2.2 DNA-AgNCs的表征 將制備好的DNA-Ag-NCs溶液放入96孔板中測定其在350～600 nm的吸光度。將DNA-AgNCs溶液用PB緩沖液稀釋10倍后，滴在噴有碳膜的銅網上，自然干燥后，使用透射電子顯微鏡觀察其形貌以及大小。

1.2.3 DNA-AgNCs對四種真菌孢子萌發的影響取1 mL PDB培養基至保藏的真菌平板上，晃動平板，將洗下的孢子收集到離心管中，用血球計數板計數并將孢子懸浮液終濃度調至1×106CFU/mL，4 ℃保存備用。參考付瑞敏等[21]的方法，在10 mL PDB培養基中加入100 μL DNA-AgNCs溶液，同時加入100 μL 1×106CFU/mL孢子懸浮液，于(28±1) ℃搖床中180 r/min培養18 h。以無菌水為空白對照組，每個處理至少觀察100個孢子，實驗重復3次。用熒光倒置顯微鏡觀察孢子萌發，計算孢子萌發抑制率。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的確定 根據Espinel-Ingroff等[22]方法，將四種1×104CFU/mL孢子懸液分別接種300 μL到96孔板中，依次加入0.25～2.75 μmol/L DNA-AgNCs溶液，在(28±1) ℃培養箱中培養3 d，用酶標儀測定570 nm處的吸光度，以無渾濁的第一個孔的濃度為MIC，實驗重復3次。

1.2.5 復合薄膜的制備 根據李雪等[5]的方法稍作修改，將5%的玉米淀粉（w/w）用磁力攪拌器在90 ℃，700 r/min糊化30 min，將1%殼聚糖（w/w）溶于1%的冰醋酸（v/v）溶液中600 W超聲至溶解，二者以8:2（v/v）的比例均勻混合，以60%的甘油（w/w）為增塑劑，攪拌均勻后超聲，用于柑橘的涂膜，其余溶液倒入玻璃板，室溫下干燥36 h，得到復合薄膜。不加DNA-AgNCs的薄膜記為S+C，加入10%DNA-AgNCs溶液（v/v）的薄膜記為S+C+Ag，加入10%分子擁擠DNA-AgNCs溶液（v/v）的薄膜記為S+C+Ag+PEG。

1.2.6 復合薄膜的表征 用掃描電鏡觀察和拍攝薄膜的形貌特征，薄膜先用液氮浸泡后破碎，每個樣品都做噴金處理，并在1.0 kV的加速電壓下操作。

力學性能按照國標GB/T 1040.1-2018[23]測定并加以改進。將復合薄膜裁成15 mm×70 mm長條，實際測量長度為55 mmol/L，測試速度為200 mm/min，每個樣品重復測量3次。

用接觸角測量儀測定復合薄膜與水的接觸角。將10 μL的蒸餾水滴在薄膜（20 cm2）表面，測量液滴兩側的接觸角，確保對稱和水平，取3次測量結果的平均值。

抗真菌性能參照Spasova等[24]的方法，將四種真菌的孢子懸液調至1×106CFU/mL，分別涂布在PDA平板上，將薄膜剪成直徑10 mm的圓片，經酒精擦拭待其揮發后放置在平板表面，(28±1) ℃培養3 d，采用十字交叉法測量各處理的抑菌圈直徑，每個樣品重復3次。

1.2.7 復合薄膜對柑橘青霉病抑制作用的研究

1.2.7.1 柑橘處理 參照黃姣麗等[25]的方法，柑橘共分為四組，每組6個，分別記為：對照組，淀粉-殼聚糖膜處理組（S+C），加入10% DNA-AgNCs溶液（v/v）的淀粉-殼聚糖膜處理組（S+C+Ag），加入10%分子擁擠的DNA-AgNCs溶液（v/v）的淀粉-殼聚糖膜處理組（S+C+Ag+PEG）。柑橘經流水沖洗后，將三個處理組分別在三種膜溶液中浸泡1 min，對照組在無菌水中浸泡1 min，待其自然晾干后，用無菌打孔器在表面赤道處對稱刺兩個深2 mm、寬2 mm的傷口，在傷口表面接種10 μL 1×106CFU/mL擴展青霉孢子懸液，將相同處理的柑橘裝在一個塑料袋內，于恒溫培養箱(28±1) ℃貯藏14 d，每隔2 d測量病斑直徑和稱重，實驗重復3次，采用十字交叉法測量果實的病斑直徑，失重率按照下式計算。

1.2.7.2 感官評價 根據裴少培[26]的方法稍作修改，采用綜合評價的方法對柑橘進行感官評價（100分制），由10位具有感官評價經驗的人組成評價小組，根據柑橘的硬度、色澤、皺縮和腐爛程度分為四個等級，重復3次，結果取平均值。感官評價標準見表1。

表1 感官評價標準Table 1 Sensory evaluation criteria

1.3 數據處理

采用Excel 2020軟件對數據進行整理，數據以均數±標準差表示，運用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，用Origin 8.6軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 DNA-AgNCs的表征

Javani等[14]結果表明，DNA序列5'-CCCCCC CCCCCC-3'合成的DNA-AgNCs有較好的抗菌效

果，加之PEG溶于水且在生物環境呈惰性[18]，且PEG 200與核仁內環境相似[15]，因此本實驗選擇以上述序列為模板，PEG 200體外模擬分子擁擠，來合成DNA-AgNCs。首先通過吸光度對正常和擁擠條件下合成的DNA-AgNCs進行表征。如圖1所示，正常條件合成的Ag和擁擠環境的Ag+PEG的吸收峰均在430 nm左右，但后者峰值較低，這與Huang等[18]結果一致，表明兩種DNA-AgNCs成功合成。由圖2可知，制備的兩種DNA-AgNCs大小均一且有良好的分散性，Ag直徑在2 nm左右（圖2A），Ag+PEG約為3 nm（圖2B），汪爾康[27]、Xu等[28]報道，含有多個C的DNA模板序列合成的DNA-AgNCs粒徑均在2 nm左右，這有利于其進入細胞內部，更好的發揮抗菌作用。

圖1 DNA-AgNCs的吸光度表征Fig.1 Absorbance characterization of DNA-AgNCs

圖2 正常DNA-AgNCs（A）和分子擁擠DNA-AgNCs（B）的電鏡圖像Fig.2 Electron microscope images of normal DNA-AgNCs(A)and molecular crowding DNA-AgNCs(B)

2.2 DNA-AgNCs的抗真菌能力

2.2.1 DNA-AgNCs抑制四種孢子萌發的能力 為探究分子擁擠對DNA-AgNCs抗真菌能力的影響，首先通過顯微鏡觀察計算孢子萌發抑制率。如表2所示，擴展青霉對DNA-AgNCs最敏感，Ag能抑制其68.940%的孢子萌發，而Ag+PEG能達到83.351%。對兩種鐮刀菌的抑制效果較差，Ag+PEG的抑制率僅有59.814%和52.803%。黃曲霉對兩種DNAAgNCs的敏感性居中，抑制率分別為61.024%和76.527%。因此，DNA-AgNCs對四種孢子都有不同程度的抑制作用，且Ag+PEG的抑制能力明顯優于Ag（P＜0.05）。AgNCs由于能使菌絲變形斷裂，增加外膜損傷，促進K+釋放，還能使活性氧、脂質過氧化、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性升高，因此有顯著的抗真菌活性[10]。Xie等[29]報道，經PEG修飾的AgNCs能夠聚集在細菌表面，進而使細胞扭曲胞膜破裂導致胞質外漏。此外，Hao等[19]實驗表明，PEG有微弱的抗菌效果，能形成水和層抑制細菌蛋白黏附，因此Ag+PEG的抑制率高于Ag的可能原因是AgNCs與PEG協同作用提高了其抗真菌能力。

表2 兩種DNA-AgNCs對四種真菌孢子萌發抑制率Table 2 Inhibition rates of two DNA-AgNCs on four kinds of fungal spores

2.2.2 DNA-AgNCs對四種真菌的MIC DNA-Ag-NCs與四種孢子懸液在96孔板培養3 d后，以完全抑制真菌生長的最低濃度（即第一個澄清孔濃度）為MIC。兩種DNA-AgNCs對擴展青霉的MIC最小（圖3A），分別為1.00和0.50 μmol/L，僅在純孢子液中看到輕微菌絲生成（圖4A）。黃曲霉在低濃度的孔壁上能看到明顯的白色菌絲（圖4B），MIC分別為1.25和1.00 μmol/L（圖3B）。Ag和Ag+PEG對禾谷鐮刀菌的MIC差距較大（圖3C），分別為2.50和1.50 μmol/L，在純孢子液中可見明顯菌絲（圖4C），后續孔中溶液也較渾濁。串珠鐮刀菌雖沒有明顯的菌絲（圖4D），但大多數孔已渾濁，直到2.50和2.25 μmol/L可見澄清（圖3D）。Malkapur等[10]制備的AgNCs對寄生曲霉和黃曲霉的MIC分別為4.5和3.5 μg/mL，Chen等[30]所制AgNCs 6.4 μg/mL即對耐藥性銅綠假單胞菌有較好的殺滅效果，因此AgNCs具有微量高效的抗菌效果。

圖3 四種真菌與兩種DNA-AgNCs培養3 d的OD值Fig.3 OD values of four fungi and two DNA-AgNCs cultured for 3 d

2.3 復合薄膜的性能分析

2.3.1 SEM圖像 對三種復合薄膜的外觀和表面結構進行觀察，雖然外觀沒有較大差異（圖5插圖），但在電鏡下的形態差異較大。如圖5A所示，無DNAAgCs的S+C薄膜表面較平整，幾乎看不到顆粒凸起，添加有DNA-AgNCs的S+C+Ag薄膜表面較粗糙（圖5B），能看到較多的顆粒均勻分散在表面，而添加分子擁擠的S+C+Ag+PEG薄膜表面雖也有顆粒在膜表面均勻分布，但較S+C+Ag薄膜平整（圖5C）。由于PEG有良好的相容性和網絡結構[31]，可以使DNA-AgNCs更充分地分散在淀粉和殼聚糖的混合溶液中，因此S+C+Ag+PEG薄膜較S+C+Ag薄膜平整，顆粒狀結構不明顯。

圖5 三種復合薄膜的SEM圖像（插圖為薄膜照片）Fig.5 SEM images of three kinds of composite films（inset is film photo）

2.3.2 力學性能 薄膜的延展性通過力學性能體現，采用質構儀對復合薄膜的力學性能進行測定。如表3所示，Ag的加入將拉伸強度由4.729 MPa提高到5.968 MPa，斷裂伸長率也從51.399%增加至60.368%。Ag+PEG的改善效果更顯著（P＜0.05），拉伸強度和斷裂伸長率分別增加至7.300 MPa和77.287%。由于DNA-AgNCs濃度低，均勻分散在淀粉和殼聚糖基質中，氫鍵的作用影響分子排列和運動，使復合薄膜結構更加緊致[32]。Kiuchi等[31]研究表明，由于PEG具有良好的相容性和網狀結構，也能降低薄膜脆性，使分子間有更大的旋轉運動。

2.3.3 接觸角 接觸角是表征薄膜疏水性的常用方法，90°是薄膜疏水性的臨界值[33]。由表3可知。加入Ag后，淀粉-殼聚糖薄膜的接觸角由59.700°增加至69.785°，這可能歸因于DNA-AgNCs與淀粉和殼聚糖的-OH相互作用形成氫鍵，使薄膜的疏水性增加[34]。而加入Ag+PEG后接觸角有所下降，為66.717°，這與SEM結果趨勢一致。Li等[35]報道，表面粗糙度的增加通常可以提高材料表面疏水性，AgNCs與顆粒團聚體之間的空隙可以截留空氣，使其表面由固體和空氣組成，從而提高了納米復合薄膜的表面疏水性。由于加入Ag后復合薄膜表面變得更加粗糙，因此S+C+Ag水接觸角最大，而S+C+Ag+PEG的表面較S+C+Ag光滑，因此水接觸角居中，S+C表面最平整水接觸角也最小。此外，薄膜在包裝食品時大多處于一個潮濕的環境，Tai等[33]指出提高疏水性能夠有效隔絕內外水分流動，減少細菌附著，起到良好的屏障作用，對薄膜的抗菌應用十分有利。

表3 復合薄膜的力學性能和水接觸角Table 3 Mechanical properties and water contact angle of composite film

2.3.4 抗真菌能力 為評估復合薄膜的抗真菌能力，將三種薄膜分別與四種真菌培養，抑菌效果由抑菌圈直徑決定。如表4所示，在沒有DNA-AgNCs加入時，S+C薄膜沒有抗菌效果，加入DNA-AgNCs后兩種薄膜有明顯的抑菌圈，其中擴展青霉的抑菌圈最大，分別為18.249和23.969 mm，而串珠鐮刀菌只有11.736和13.349 mm，且S+C+Ag+PEG的抑菌圈直徑顯著大于S+C+Ag（P＜0.05），這與2.2中DNAAgNCs的抗真菌能力相對應，表明S+C+Ag+PEG復合薄膜有更顯著的抗菌效果。

表4 三種復合薄膜的抑菌圈直徑Table 4 Diameter of bacteriostatic zone of three kinds of composite films

2.4 復合薄膜對柑橘青霉病抑制作用

2.4.1 復合薄膜對柑橘失重率和病斑直徑的影響果蔬在采摘后由于蒸騰和呼吸作用消耗自身的水分和養分，重量會持續下降。由圖6可知，柑橘在接種青霉之后重量不斷下降，在2 d僅對照組失重率超過5%，其他三組均在4%左右。隨著時間的增加，對照組失重率幾乎呈倍數增長，14 d時高達32.5%，且與S+C組無顯著性差異（P＞0.05）。而S+C+Ag+PEG組失重率僅為23.8%，與對照組第10 d的水平相當，且與其他三組有顯著性差異（P＜0.05），這表明S+C+Ag+PEG復合涂膜能夠延緩柑橘重量損失。

圖6 復合薄膜對柑橘失重率的影響Fig.6 Effects of composite film on weight loss rate of citrus

柑橘在貯藏期間常由于磕碰造成表皮受損增加微生物侵染的幾率，因此通過刺傷接種孢子液來模擬此情況。如圖7所示，第2 d四組均沒有明顯的病斑，4 d時對照組可見0.6 cm病斑 直徑，S+C和S+C+Ag僅0.4 cm，S+C+Ag病斑依舊不明顯。在14 d時，對照組病斑直徑達3.3 cm，而S+C+Ag+PEG病斑僅2.3 cm，與10 d時對照組直徑相似。結合圖8可以看出，S+C+Ag+PEG處理組在第10 d可見明顯菌斑，其余三組在第6 d即可見菌斑生成。三組涂膜處理的病斑直徑均小于對照組，且S+C+Ag+PEG處理組效果最顯著（P＜0.05），這與前面Ag+PEG的強抗菌能力相對應，表明S+C+Ag+PEG復合涂膜能夠顯著抑制病斑擴散（P＜0.05）。

圖7 復合薄膜對柑橘病斑直徑的影響Fig.7 Effects of composite film on spot diameter of citrus

2.4.2 復合薄膜對柑橘感官品質的影響 柑橘在貯藏期間質量逐漸下降，視覺評價是品質評估最直觀的方式。如圖9所示，起初四組無顯著性差異（P＞0.05），評分均在90分以上，顏色鮮亮，果皮柔韌有彈性。第6 d開始，對照組已降至60分，結合圖8可看出，開始出現明顯病斑，外皮光澤度下降，S+C和S+C+Ag僅在接種除有較少菌絲，三個涂膜處理組評分均在70分以上。在第10 d時，對照組降至33分，病斑內陷并伴有綠色孢子產生，外皮堅硬粗糙失去光澤；S+C組患病處有輕微內陷和少量菌絲，果皮失去彈性硬度增加；S+C+Ag和S+C+Ag+PEG僅有病斑直徑的增加，外皮的彈性和亮度還維持在較高的水平。直至第14 d，對照組僅有17分，柑橘腐爛嚴重并產生酸腐味液體；S+C和S+C+Ag組已不足40分，外皮粗糙暗淡，患病處內陷，有異味產生；S+C+Ag+PEG組評分還在50以上，外皮脆性逐漸增加，光澤度有輕微下降，但沒有明顯的氣味變化。綜上所述，柑橘在貯藏14 d內感官品質不斷下降，其中對照組下降最快，S+C+Ag+PEG品質最好，顯著優于其他三組（P＜0.05），因此S+C+Ag+PEG復合涂膜能夠有效延緩柑橘感官品質的降低。

圖8 不同處理下柑橘14 d內外觀變化Fig.8 Appearance changes of citrus under different treatments in 14 d

圖9 復合涂膜對柑橘外觀品質的影響Fig.9 Effects of compound coating on appearance quality of citrus

3 結論

本研究在分子擁擠條件下合成的DNA-AgNCs有廣譜抗真菌效果，其中對擴展青霉效果最明顯，孢子萌發抑制率達83.351%，MIC僅為0.5 μmol/L，對其他真菌的抑制率也均在50%以上，MIC不超過2.5 μmol/L。將DNA-AgNCs加入淀粉-殼聚糖溶液中制備復合薄膜，能有效改善薄膜的韌性，賦予薄膜良好的屏障作用和抗菌效果。作為涂膜使用在青霉侵染的柑橘中，S+C+Ag+PEG涂膜能有效延緩柑橘重量損失，14 d內失重率僅有23.8%，還能有效抑制病斑蔓延，在接種孢子液14 d后病斑只有2.3 cm，對青霉病有較好的防治效果，且能將柑橘品質維持在較高的水平。本研究為DNA-AgNCs的應用提供新方向，更好地滿足食品包裝的多樣化應用需求。